ヒト狂犬病ワクチンの製造における限外濾過の応用
ヒト狂犬病ワクチンの製造における限外濾過の応用を促進するために、300kDaの限外濾過膜カセットを使用して狂犬病ウイルス採取溶液を濃縮し、限外濾過後の抗原回収率、エンドトキシン除去率、宿主タンパク質除去率を検出しました。結果は、適切な圧力下で、狂犬病ウイルス採取溶液は80倍濃縮され、25倍溶出され、抗原回収率は86.2％、細菌エンドトキシン除去率は87.5％〜88.7％、宿主タンパク質除去率は91.6％でした。
序文
狂犬病は、狂犬病ウイルス（RV）によって引き起こされる伝統的で古代の人獣共通感染症であり、致死率は100％にも達します。現在、緊急ワクチンと免疫グロブリンワクチン接種以外に、曝露後（つまり、皮膚と粘膜の損傷）に対する有効な治療法はありません。人間における狂犬病の主な感染源は、病気の動物または感染の可能性がある動物（主に犬）による咬傷です。中国の狂犬病の死亡率は世界第2位であり、狂犬病は我が国の公衆衛生の安全を脅かす問題の一つです。狂犬病ウイルスの莢膜糖タンパク質は、防御中和抗体の産生を誘発する唯一の重要な抗原であり、狂犬病ウイルスの新しいワクチンと新しい診断および治療技術の研究開発の焦点となっています。
狂犬病ウイルスはラブドウイルス科狂犬病ウイルス属に属し、核カプシドの形状は弾性があり、核カプシドはらせん対称で、表面には一本鎖RNAを含むエンベロープがあり、狂犬病を引き起こす病原体です。狂犬病ウイルスには2つの主な抗原があります。1つはウイルスの外膜にある糖タンパク質抗原で、アセチルコリン受容体に結合してウイルスを神経毒性にし、体内で中和抗体と血球凝集抑制抗体を生成し、中和抗体は防御効果があります。もう1つは内側のリボタンパク質抗原で、体内で補体結合抗体と沈降素を生成させますが、防御効果はありません。
エンドトキシンはリポ多糖類物質（LPS）の一種で、耐熱性と化学的安定性があり、破壊されにくい物質です。ワクチンに一定濃度のエンドトキシンが含まれていると、ワクチン接種後に重度の発熱や死亡を引き起こす可能性があるため、ワクチン中のエンドトキシンの含有量は可能な限り減らす必要があります。2005年版中国薬局方（第3部）では、狂犬病ワクチンのエンドトキシンの合格指標の制御値は100EU/用量を超えてはならないと定められています。膜分離技術の急速な発展に伴い、ワクチン中のエンドトキシン含有量を減らすための限外濾過膜分離技術の応用は、製薬業界でますます広まっています。
狂犬病ワクチンは狂犬病に対するワクチンです。狂犬病ワクチンには通常、精製ベロ細胞ワクチン、ヒト二倍体細胞ワクチン、一次細胞培養ワクチンの3種類があります。狂犬病ワクチンは、狂犬病ウイルス固定ウイルスを細胞マトリックスに接種し、培養、採取、濃縮、不活化、精製、適切な安定剤の添加を経て製造されます。狂犬病ワクチンの主な機能は、体に迅速な免疫反応を起こさせ、狂犬病ウイルスに対する防御抗体を生成させることで、ウイルスによる感染を防ぎ、病気のリスクを軽減することです。
ワクチンの製造工程はワクチンの品質を確保する上で重要な役割を果たしており、特に製造工程におけるいくつかの指標の定量化はより重要です。ヒト狂犬病ワクチンの製造工程において、限外濾過濃縮技術はヒト狂犬病ワクチンを製造するための必須の手段です。限外濾過濃縮に合理的な開口の限外濾過膜を使用すると、エンドトキシンと宿主タンパク質を効果的に除去し、RV抗原を保持することができ、ワクチンの製造と品質の向上に役立ちます。RV分子の相対分子量は350kDa〜460kDaであり、理論的には、遮断分子量が100kDaと300kDaの膜カセットを使用した限外濾過濃縮により、RVを完全に捕捉できます。エンドトキシンは、異なる水溶液で凝集構造を形成することが多く、凝集の程度によって分子サイズが異なります。 エンドトキシンモノマーの相対分子量は10kDa～20kDaであり、その重合形態の相対分子量は300kDa～1000kDaまたは1000kDa以上である。分子量の違いに基づいて、ヒト狂犬病ワクチン中のRV抗原は保持され、ヒト狂犬病ワクチン中のエンドトキシンと宿主タンパク質は300kDa限外濾過膜によって除去された。
この実験では、3 00kDa の開口部と 0.11m2 の膜面積を持つ限外濾過膜カセットを少量サンプル処理として使用し、ヒト狂犬病ワクチン中間生成物を濃縮し、膜透過流束、処理効率、濃縮倍数、抗原遮断、エンドトキシン除去、および宿主タンパク質除去を試験した。
2材料方法
2.1 実験材料
狂犬病ウイルス固定ウイルスCTN-IV株、Vero細胞、0.5M水酸化ナトリウム、300kDa限外濾過膜カセット（PES素材、膜面積0.11m²）。
2.2 実験方法
2.2.1 ウイルス採取溶液の調製
凍結したVero細胞を37度〜39度の温水で蘇生させ、細胞懸濁液をすくい取り、10%不活化子牛血清を含む199培地に加えました。均一な単層細胞を37度で培養しました。CTN-IV株に狂犬病ウイルスを0.1mol/Lの割合で接種し、37度で培養しました。48時間後、培地を捨て、0.1%ヒト血液アルブミンを含む199培地を加えて、培養を33度〜35度に維持しました。3日ごとに1回病毒を採取し、複数回の採取液を組み合わせます。
2.2.2 メンブレンカセットの取り付け
メンブレンカセットを取り付け、下図のように配線を接続します。
2.2.3 水洗浄
入口バルブ、戻りバルブ、貫通バルブを閉じ、戻り端と貫通端のパイプを廃液タンクに挿入します。吸入タンクに注入用水1Lを入れます。
入口バルブと戻りバルブを開き、スルーバルブを閉じ、ポンプを開き、戻りラインを 1% 量の精製水または注射用水で洗浄し、入口圧力を 0.35bar (5psi) に維持します。
フィルターバルブを開き、戻りバルブを閉じ、残りの注入水を使用してフィルターパイプを洗浄し、TMP を 0.35bar に維持します。
2.2.4 消毒
入口バルブ、戻りバルブ、伝送バルブを閉じ、戻り端と伝送端のラインを廃液タンクに挿入します。吸入タンクに洗浄液2Lを入れます。
入口バルブと戻りバルブを開き、スルーバルブを閉じ、ポンプを開き、戻りラインを 200mL の 0.5M 水酸化ナトリウムで洗浄し、入口圧力を 0.35bar (5psi) に維持します。
スルーバルブを開き、リターンバルブを閉じ、TMPを0.35barに維持しながら、200mLの洗浄液でスルーパイプを洗浄します。
次に、戻り端と貫通端パイプを液体タンクに挿入して循環洗浄します。 プロセス接線流量の1〜1.5倍で30分間循環洗浄します。
0.5M 水酸化ナトリウムを排出し、2.2.4 に従って注射用水で中性になるまで洗浄します。
2.2.5 水フラックス試験
取水タンクに精製水を追加し、取水タンク内の水温を計測して記録します。戻り端をタンクに挿入します。ポンプを始動し、ポンプ速度と戻りバルブを調整して、0.35bar (5psi) の膜間圧力差を実現します。シリンダーを使用して、スルーエンドでの流量を mL/分で計測して記録します。ポンプ速度と戻りバルブを調整して、膜間差圧が 1bar (15psi) になるようにします。シリンダーを使用して、スルーエンドでの流量を mL/分で計測して記録します。
水流量値を標準化するには、計算された水流量値を膜間圧力差で割り、次の表の温度補正係数を掛けます。
2.2.6 限外濾過濃縮
バッファートップでシステムから水を洗い流します。システムの pH とイオン安定性を調整するために 5 分間サイクルします。温度を調整する必要がある場合は、システム温度が安定するまでサイクルを続けます。
供給液を吸入タンクに追加し、供給流量（例：400LMH）を設定し、さまざまな TMP 値で通過流量をテストします。テスト データに従って、TMP を横軸、Flux を縦軸として曲線が描かれました。
スルーエンドパイプを、スルーエンド収集タンク、廃液タンク、プロセス排水管などの適切な容器または排水管に導きます。
供給タンク内の供給液の初期重量を記録し、供給ポンプを始動し、供給液を 3 ～ 4 分間ゆっくりと循環させます。循環により、流路内の残留空気が除去され、フィルムの性能が最大限に高まります。
スルーバルブを開き、最適な接線流量に達するまでポンプ速度をゆっくりと上げ、リターンバルブを調整してシステムの最適な TMP を実現します。
次に、チューブを収集容器に入れ、液体が容器に入るときに時間を計り、適切な間隔で入口圧力と戻り圧力を記録し、戻り端と通過端で時間の経過に伴う液体の品質を記録して、瞬間流量を計算します。
供給液の液量が目標濃度量まで減少すると、サンプルの限外濾過濃縮が完了します。
2.2.7 透析
吸入管、補給管、戻り管を吸入タンクに入れ、伝達管を回収容器に入れ、回収容器を天秤の上に置いてクリアします。
戻りバルブを開き、入口ポンプを起動し、貫通バルブを開き、ポンプ速度とTMPを適切な値に調整します。補充ポンプを開き、吸入タンク内の液体量を変更せずに、等量透析を開始します。液体が容器に入るときにタイミングを開始し、適切な時間間隔で入口端、戻り端の圧力と液体の質量を記録し、計算によって瞬間流量を取得します。
2.2.8 化学反応
まず緩衝液ですすぎ、次に注射用水ですすぎ（操作 2.2.3）、次に洗浄剤で洗浄し（操作 2.2.4）、最後に注射用水ですすいでください（操作 2.2.3）。
2.2.9 水フラックス試験
操作は次のとおりです: 2.4.5.
2.2.10 膜カセットの保存
短期間の保管（3日以内）の場合は、膜カセットを固定具に入れたまま、保管溶液を使用して10分から15分間循環させ、システムバルブを閉じ、液体ポンプへの電源を切断し、液体入口タンクが正しく密閉されていることを確認します。
保管期間が3日から1か月の場合は、メンブレンカセットを器具から取り外し、ビニール袋などの密閉容器に密封してください。ビニール袋または密閉容器に保管溶液を約50mLから100mL加えて密封します。または、保管溶液に直接浸すこともできます。次の表は保管条件を推奨しています。
3 結果と分析
3.1 発熱物質除去効率に影響する要因の調査
限外濾過操作圧力：15回の試験バッチを連続的に実行しました。各バッチでは、限外濾過中に濾過圧力を5、10、15、2{{10}}psiに維持し、ウイルス採取液を30倍濃縮し、緩衝液（10倍容量）で連続流で溶出しました。結果は下表のとおり、エンドトキシンの除去率は87.0％未満、抗原の回収率は86.0％で安定、宿主タンパク質の除去率は90.0％で安定しており、異なる操作圧力が抗原の回収、エンドトキシン除去、宿主タンパク質除去の効果にほとんど影響を与えないことがわかりました。
限外濾過濃縮比：15の試験バッチを連続的に実行しました。各バッチでは、限外濾過中にウイルス採取液がそれぞれ30倍、50倍、80倍、100倍に濃縮されました。濾過圧力は20psiに維持され、緩衝液（10倍の容量）が連続流で溶出されました。結果は次の表に示すように、エンドトキシンの除去率は53.3％から86.9％の範囲で、抗原回収率は86.0％で安定しており、宿主タンパク質の除去率は91.0％で安定していました。セグメントサンプリングでは、透過溶液に抗原は検出されず、濃縮ウイルス溶液に残った宿主タンパク質は10％未満でした。 ウイルス濃縮液中のエンドトキシン濃度は濃縮倍数の増加とともに増加し、エンドトキシン除去率は80倍濃縮サンプルで最も高く、メーカーは100倍濃縮も検討することができ、生産効率の向上とコスト削減だけでなく、ワクチン生産の要件も満たすことができました。
3.2 膜カセットフラックスの枯渇と洗浄再生
処理後、膜フラックスの回復率は92.6%でした。新しい膜カセットの最初の回復率は正常で、供給液の現在の観察特性によると、その後の2回目とNTH回の予測では、膜カセットのフラックスの回復率はこの処理後のデータに近くなり、安定する傾向があります。単回使用の2時間以内に、膜カセットの枯渇は理想的であり、全体的な操作で膜フラックスの10%のみが枯渇しました。
3.2.1 膜カセット処理過程におけるフラックスの減少
3.2.2 膜カセットの洗浄と再生の結果
ガイドリングについて
貴晶科技は、バイオ医薬品、細胞培養、バイオ医薬品の精製と濃縮、診断、工業用流体に重点を置く国家ハイテク企業です。当社は、バイオ医薬品、細胞培養などの応用シナリオに完全に適合する遠心濾過装置、限外濾過および精密濾過カセット、ウイルスフィルター、TFFシステム、デプスフィルター、中空糸などの開発に成功しました。当社の膜と膜フィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過の濃縮、抽出、分離に広く使用されています。小型の使い捨て実験室濾過から生産濾過システム、無菌試験、発酵、細胞培養など、当社の多くの製品ラインは、試験と生産のニーズを満たしています。貴晶科技はあなたとの協力を楽しみにしています！