MRNA 医薬品製造プロセスの完全分析: TFF テクノロジーが精製の課題をどのように解決するか

近年、mRNA技術はバイオ医薬品分野で画期的な進歩を遂げ、特にワクチンや遺伝子治療において多大な応用可能性を示しています。 mRNA ワクチンの開発の成功は、感染症の予防と制御のための新しい解決策を提供しただけでなく、がん免疫療法や個別化医療の進歩も推進しました。新しい種類の治療薬であるため、大規模な mRNA 製造は非常に困難であり、RNA の安定性の制御、残留酵素と生成物による反応の除去、緩衝液交換、高純度回収率の達成などが含まれます。これらすべてに規制-されたソリューションを使用した製造技術が必要です。-

mRNAワクチンまたは治療薬の製造プロセスは、主にプラスミドDNA原液の調製、mRNA原液の調製、mRNA-LNP製剤の調製の3段階に分かれています。

mRNA医薬品の製造工程フローチャート

 

タンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF) は確立された膜分離技術であり、高効率の分子ふるい機能、制御可能な緩衝液交換、低せん断応力特性により、mRNA 製造に広く適用されています。{{1}膜モジュール設計に基づいた一般的な TFF 構成には、フラット シート カセットと中空ファイバー モジュールが含まれます。{{3}さらに、TFF における圧力による膜分離は、膜の孔径に応じて精密濾過 (MF)、限外濾過 (UF)、ナノ濾過 (NF)、および逆浸透 (RO) に分類でき、選択性は徐々に増加します。

 

TFF は、プラスミド DNA バルクの調製、mRNA バルク生産、mRNA-LNP 医薬品の最終製剤など、mRNA 医薬品製造の複数の段階にわたって重要な役割を果たします。膜の種類、分画分子量（MWCO）、膜材質を適切に選択することで、TFF は生成物や低分子量不純物による反応を効率的に除去できます。また、LNP カプセル化の前後でのバッファ交換と濃縮も容易にします。-これにより、RNA の純度、安定性、および全体的なプロセスの拡張性が大幅に向上します。

 

さらに、接線流ろ過の性能は、ポンプのタイプやチューブ設計などのシステム構成要素のほか、膜貫通圧 (TMP)、せん断応力、ろ過流束などの主要なプロセス パラメーターにも影響されます。これらの要素は、ターゲット製品の特性に基づいて慎重に選択し、最適化する必要があります。特に、mRNA-LNP などのストレスに敏感な製品の場合は、加工中に機械的な外部力の影響を非常に受けやすくなります。{1}}

 

プラスミドDNAの精製

プラスミド DNA ストック溶液の調製は、基本的に転写テンプレートの配列設計に基づいています。調製方法には通常、プラスミド DNA の増幅が含まれますが、PCR 増幅も使用できます。 DNA増幅を例に挙げると、大腸菌発酵ベースの増幅によく使用されます。{0}下流の精製プロセスには主に、細胞の収集、溶解と清澄化、濃縮と緩衝液交換、滅菌濾過、線形化、およびクロマトグラフィー精製が含まれます。産業環境では、細胞収集に連続フロー遠心分離がよく使用されますが、比較的高いせん断力が発生します。中空ファイバーシステムは、オープンチャンネルと低せん断力を備えており、プラスミド DNA など、固形分が多く、粘度が高く、せん断感度が高いサンプルの取り扱いに適しています。収集後、細胞は高圧ホモジナイズ、超音波処理、またはアルカリ溶解にさらされ、続いて深層濾過による予備清澄が行われます。{6}

 

その後のクロマトグラフィーを容易にするために、分子量カットオフ 30 kDa、100 kDa、または 300 kDa の膜カセットまたは中空糸カラムを使用したタンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF) が最初に濃縮とバッファ交換によく使用されます。{0}これにより、サンプル量が減少すると同時に、RNA、宿主細胞タンパク質 (HCP)、宿主細胞 DNA 断片 (HCD) などの一部の不純物が除去されます。クロマトグラフィーはコア精製ステップとして機能します。通常、陰イオン交換クロマトグラフィー (AEX) と疎水性相互作用クロマトグラフィー (HIC) を組み合わせて不純物を効率的に除去し、生理活性の高いスーパーコイルプラスミド DNA を濃縮し、それによってプラスミドの純度を大幅に向上させます。

 

精製後、プラスミドを再度 TFF に供して、溶液を目標濃度 (通常 0.5 ～ 2 mg/mL) まで濃縮し、最終保存緩衝液で透析を行います。このステップではプロセスから残留塩と有機溶媒を除去し、バッファー系が下流の in vitro 転写 (IVT) 反応の要件を確実に満たすようにします。

 

インビトロ転写 (IVT) mRNA の精製

In vitro 転写 (IVT) と修飾は、mRNA ストック溶液を調製するための重要なプロセスです。 IVT mRNA の生成中には、タンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF1) - クロマトグラフィー - タンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF2) の組み合わせが使用されます。この戦略により、mRNA の効率的かつ高品質な精製が保証され、ワクチン製造に重要なサポートが提供されます。{4}

転写および修飾反応が完了したら、通常、分子量カットオフ 30 kDa、100 kDa、または 300 kDa の膜カセットまたは中空糸カラムを使用した限外濾過 / ダイアフィルトレーションが最初に実行されます。{0}このステップでは、RNA ポリメラーゼ、残留 DNA 断片、未反応 NTP、キャッピング酵素、二本鎖 RNA (dsRNA)、低分子阻害剤などのさまざまなプロセス関連不純物を反応系から効果的に除去します。同時にバッファー交換を行います。- 1 回のタンジェンシャルフローろ過ステップの後、ほとんどの不純物は効果的に除去され、検出可能な残留タンパク質不純物は RNA ポリメラーゼのみです。

続いて、さらなる精製のために複数のクロマトグラフィー技術が適用されます。一般的に使用される方法には、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン-対逆相クロマトグラフィー-、イオン交換クロマトグラフィーなどがあります。-。限外濾過と連続クロマトグラフィーのこの組み合わせにより、mRNA は高レベルの純度を達成します。

 

製剤または保存の要件を満たすために、mRNA 原液は 30 kDa、100 kDa、または 300 kDa の膜カセットまたは中空糸カラムを使用して再度濃縮または希釈され、標的濃度を正確に調整し、最終製剤バッファーに交換されます。最後に、微生物負荷を制御するために滅菌-グレードのろ過が適用され、材料の一時的な保管と充填が完了します。

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25LMH）。

 

mRNA の精製-LNP 製剤

脂質ナノ粒子 (LNP) は、現在、mRNA 治療薬の送達システムとして最も広く研究されています。現在、さまざまな mRNA-LNP 製剤が前臨床および臨床開発のさまざまな段階にあります。 LNP は製造プロセスに非常に敏感です。 mRNA-LNP 生成に必要な単位操作の中でも、タンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF) による濃縮とバッファー交換、および滅菌ろ過は大きな課題となります。これらのステップは、膜の汚れや不適切なフィルターの装填などの問題を回避しながら、プロセスの拡張性と製品の品質を確保するために慎重に最適化する必要があります。

 

mRNA のカプセル化後、タンジェンシャル フロー フィルトレーション (TFF) を使用して精製します。このステップの目的は、カプセル化されていない mRNA、遊離ポリマーまたは脂質材料、および mRNA と脂質から残留溶媒を除去することです。 mRNA-LNP は室温では安定性が限られているため、製品の品質を維持するには TFF を含む下流プロセスの最適化が重要です。

主要な最適化の方向性としては、mRNA-LNP の粒子サイズと安定性に基づいて膜貫通圧 (TMP) と接線流量を適切に設定し、ろ過効率と粒子ストレスのバランスをとることが挙げられます。粒子の吸着や損傷を最小限に抑えながら遊離 mRNA、不純物、交換バッファーを効率的に除去するために、適切な分子量カットオフ（MWCO、たとえば 100 kDa または 300 kDa）を持つ膜または中空糸カラムを選択します。{{1}濃度と透析ろ過量を最適化して、ターゲット製剤への効果的な緩衝液交換を確保し、最終的な粒子濃度と分散度を制御します。

 

さらに、プロセス中に重要な品質特性（粒子サイズ、多分散性指数 [PDI]、mRNA カプセル化効率など）を綿密に監視し、リアルタイム データに基づいてパラメータを動的に調整して、安定したスケーラブルで効率的な mRNA LNP の精製と製剤化を達成する必要があります。-

 

さらに、mRNA-LNP とその成分は最終滅菌法では不安定であるため、通常、細菌やその他の微生物汚染物質を除去するために 0.2 µm の滅菌グレードのフィルターが使用されます。-