供給液の濃度が限外濾過カセットに及ぼす影響は何ですか？
私がフィルター サプライヤーとして初期の頃に限外濾過 (UF) カセットを使い始めたとき、処理している溶液が「十分に濃い」かどうかを確認すること以上に、飼料濃度についてあまり考えていなかったということを認めます。状況は急速に変わりました。あるバイオテクノロジー企業の顧客が抗体濃縮ステップで壁にぶつかり、頻繁な詰まりと奇妙に一貫性のないフラックスレートのせいだと主張したときです。結局のところ、彼らは UF カセットが処理できる量をはるかに超えて作業を進めており、そのために数日間のダウンタイムと高価な製品のバッチが犠牲になっていました。 UF カセットを使用している場合、これは単なる細かい点ではなく、歩留まりから実行時間まで、プロセスの成否を左右する最大の要因の 1 つです。飼料濃度が UF のあらゆる部分にどのような影響を与えるか、そして物事をスムーズに進めるために私が長年にわたって学んだことを詳しく見てみましょう。
まず、同じ認識を持っていることを確認するために、これを UF カセットの実際の動作に基づいて考えてみましょう。ゲームを初めて使用する場合は、UF カセットは平らな膜を備えた自己完結型のユニットです (フラットシートカセット詳細な内訳については、このページを参照してください)。分子をサイズ別に分離します。小さなものは膜を通過しますが、大きなものは「保持」され、フィード側で濃縮されます。なぜバイオ医薬品、食品と飲料、廃水の分野でこれほど人気があるのでしょうか?コンパクトで再利用可能 (適切に洗浄すれば場合によっては) で、古い手作業でカットされたメンブレンのセットアップよりもはるかに安定しています。のカセット限外濾過当社が提供するラインは、実験室での小規模なバッチから完全な製造まで、スケーラブルな実行向けに構築されています。そのため、当社はスタートアップのバイオテクノロジー企業から世界的な食品ブランドに至るまで、さまざまなクライアントと協力してきました。
用語を詳しく理解していない人のために説明すると、フィード濃度は基本的に、カセットに送り込む溶液中のターゲット (または不要な) 溶質の量です。たとえば、細胞培養ブロスからモノクローナル抗体 (mAb) を濃縮する場合、ここでのフィード濃度は、そのブロス 1 リットルあたりの mAb のグラム数です。標的だけではありません。細胞破片、培地成分、残った緩衝塩などの不純物も混入しています。フィード濃度のスイートスポットは、膜の分画分子量 (MWCO) によって異なります。 30KD UF カセットは小さなタンパク質に最適ですが、500KD はウイルスベクターのような大きな分子に適しています。飼料の濃度に関係なく、クライアントが最初に見たカセットを手に取るのを見てきましたが、そこから間違いが始まります。
最も直接的な影響である流動率から始めましょう。流束は、1 時間あたりの単位面積あたりの膜を通過する溶液の量であり、UF の生産性の根幹です。フィード濃度が高すぎると、流束は直線的にではなく急速に低下します。その理由は次のとおりです。溶液を処理すると、保持された溶質が膜表面近くに蓄積し、「濃度分極層」と呼ばれるものを形成します。この層は追加のバリアとして機能するため、水と小さな溶質は通過するためにさらに努力する必要があります。供給濃度が最初から非常に高い場合、分極層は急速に厚くなり、すぐに透過物がほとんど押し出されなくなります。昨年、私は高密度の細胞培養上清に対して 30KD の限外濾過カセットを実行しているクライアントがいました。私たちの推奨値が 10 ～ 15 g/L であったとき、彼らは 25 g/L のタンパク質を供給していました。フラックスは 2 時間で 60 L/m2/hr から 12 L/m2/hr に低下し、カセットをクリーニングするために途中でシャットダウンする必要があり、12 時間の稼働時間が無駄になりました。さらに悪いことに、高濃度の分極により一部のタンパク質がその層に詰まり、その収量が予想より 18% 低くなりました。
しかし、それはフラックスだけではありません。供給濃度もまた、UF の大きな問題である膜の汚れに直接関係します。ファウリングとは、溶質、破片、または凝集体が膜表面または細孔壁に永久に付着することを指しますが、供給物が過剰に濃縮されるとさらに悪化します。溶質がフィード内に詰まっていると、膜に衝突して捕捉される可能性が高くなります。私は何年にもわたって何百もの UF カセットを洗浄してきましたが、80% の場合、ひどい汚れは推奨範囲の 2 ～ 3 倍の飼料濃度に遡ります。たとえば、フルーツ ジュースを加工する食品顧客は、1 回のパスで 15° Brix (10KD カセットのスイート スポット) ではなく、30° Brix まで濃縮したいと考えていました。ジュースのペクチンと砂糖は 30 分以内に膜上に蓄積し始め、分析の終わりまでに膜の細孔が部分的に詰まったため、期待した濃度の 4 分の 1 しか得られず、10 回の分析ではなく 3 回の分析後にカセットを交換する必要がありました。そのため、毎回低い供給濃度で濃縮を 2 回のパスに分割する場合よりも、1 リットルあたりのコストがはるかに高くなりました。
収量も飼料濃度が大きな影響を与える分野であり、特に製品のグラム単位が重要となるバイオ医薬品においては顕著です。飼料が濃縮されすぎると、汚れが増えるだけでなく、2 つの点で製品の損失が発生し始めます。まず、濃度分極層はターゲット分子を捕捉できますが、厚くなりすぎると、カセットを排出するときにそれらの分子は濃縮されずに保持液と一緒に持ち去られてしまう可能性があります。第二に、一部の標的分子 (タンパク質など) は高濃度で凝集を開始する可能性があり、それらの凝集体は多くの場合、膜をすり抜けたり、透過液に引っかかったりするほど小さいため、失われます。昨年私が協力したウイルスベクタークライアントは、当社の 500KD 限外濾過カセットを使用して AAV ベクターを濃縮していました。供給濃度を 1mL あたり 1e13 ベクターゲノムまで押し上げましたが、これは当社が推奨する 2e12 を大幅に超えています。飼料濃度を適切な範囲に下げた場合の収率は 82% だったのに対し、収量はわずか 45% でした。保持液をテストしたところ、標的ベクターの 30% が濃度分極層に付着しており、さらに 15% が凝集して失われていることがわかりました。これは、特に気まぐれに製品を増やすことができない GMP 準拠のプロセスを扱っている場合に、バッチ全体が無価値になる可能性がある種類のヒットです。
ちょっと待ってください。しかし、「飼料濃度は低いほうが常に良い」と考える前に、それも真実ではありません。フィードが薄すぎると、時間とカセットの容量が無駄になります。 UF は、溶液を適切なレベルまで濃縮している場合に最も効率的ですが、薄すぎるフィードから開始すると、必要以上に多くの体積を移動させることになり、ポンピングにかかるエネルギー コストが増加し、目標濃度に到達するまでに時間がかかります。たとえば、少量のタンパク質サンプルを濃縮しているラボクライアントは、供給濃度 0.1 mg/mL の 10KD カセットを使用していました。彼らは 10 mg/mL に到達しようとしていたため、10 mL の保持液を得るために 100 mL の溶液を処理していました。最初に遠心分離によって飼料を 0.5 mg/mL に濃縮した場合は 2 時間かかったのに対し、8 時間かかったので、処理したのは 20 mL だけでした。これは、特に 1 日に複数のバッチを実行している場合、労力と時間に大きな違いがあります。鍵となるのは、特定のカセットとアプリケーションの中間範囲、つまり私が「集中ウィンドウ」と呼ぶ範囲に到達することです。
では、その集中ウィンドウはどうやって見つけ出すのでしょうか?これは万能ではありませんが、すべてのクライアントと共有する経験則がいくつかあります。まず、カセットの MWCO を確認します。通常、MWCO が高いカセット (500KD など) は、MWCO が低いカセット (30KD など) よりも高い供給濃度を処理できます。これは、細孔が大きいため、分極が問題になりにくいためです。私たちのカセット-TFF-ろ過シリーズページには各カセットの特定の濃度範囲が記載されていますが、原則として、ほとんどのタンパク質用途では総固形分が 10 ～ 15%、小分子の場合は 5 ～ 10% を超えないようにしてください。次に、フィードの不純物をテストします。フィードに破片や凝集物が多く含まれている場合は、ターゲット分子が何であっても、汚れを避けるためにフィード濃度を低くする必要があります。 3 番目に、いきなり完全な運用に移行するのではなく、最初に小規模なテストを実行します。 100 mL または 1 L のテスト実行により、得られるフラックス、汚れが定着する速度、期待できる収量が正確にわかるため、貴重な製品を無駄にすることがなくなります。
私が長年にわたって気づいてきたもう 1 つのことは、供給濃度がクロスフロー速度や膜間圧力 (TMP) などの他のプロセス パラメーターと相互作用するということです。これは真空中での濃度調整のようなものではありません。供給濃度が高い場合は、膜表面から偏光層を一掃するクロスフロー速度を増加させ、TMP を増加させることで多少の補正ができます (ただし、TMP は偏光層の圧縮を引き起こす可能性があるため、あまり多くはありません)。しかし、これはバランスをとる行為です。クロスフローが高くなるとエネルギーが多くなり、TMP が高くなると、注意しないと膜の損傷につながる可能性があります。 1 つを変更すると他のパラメータが狂ってしまう可能性があるため、私たちは常にお客様に飼料濃度を含む完全なパラメータ テストを実行するようアドバイスしています。たとえば、あるクライアントはかつて、TMP を上げて高い供給濃度による流束低下を修正しようとしたが、最終的に膜を圧縮してしまい、次回の実行ではさらに流束が低くなってしまいました。だからこそ、当社では、単にカセットを販売するだけではなく、お客様がこのようなプロセスの不具合に対処できるよう支援するのです。なぜなら、飼料濃度に関して犯し得るほぼすべての間違いを見てきたからです。
飼料濃度は 1 回の運転に影響を与えるだけでなく、カセットの寿命にも影響するため、長期的な影響についても説明しましょう。過剰に濃縮されたフィードを使用して運転している場合、より多くの汚れが生成されます。つまり、蓄積物を取り除くためにカセットをより頻繁に掃除し、より強力な洗浄剤（より高い pH や温度など）を使用する必要があります。時間の経過とともに、この積極的な洗浄によりメンブレンが劣化するため、カセットの交換が必要になるまでのカセットの実行回数が少なくなります。フラット シート カセットを使用しているクライアントがあり、5 回目の実行までに汚れがひどいため交換しなければならなくなりました。一方、同じカセットを適切な飼料濃度で実行している別のクライアントは 15 回以上の実行を行っていました。カセットを毎週使うのと毎月使うのでは、コストに大きな違いがあります。
さて、実際的な話に移りましょう。飼料の濃度がずれている場合、実際に何をすべきでしょうか?まずは、きちんと計測してみましょう。多くのクライアントはソリューションの「視覚的な厚さ」を基準にしていますが、これは非常に不正確です。正確な濃度を得るには、食品の場合は Brix 計を使用するか、吸光度 (タンパク質の場合は A280 など) を使用します。次に、飼料が高すぎる場合は希釈するか、低すぎる場合はより小さな前処理ステップ (別のカセットを使用した接線流濾過や遠心分離など) で飼料をさらに濃縮して、飼料を調整します。カスタム生物製剤など、独自の飼料を扱っている場合は、当社のチームにお問い合わせください。当社には、適切な MWCO (30KD 対 500KD など) の選択、クロスフローの調整、または最適な実行時間の把握など、飼料濃度に合わせたプロセスの設計を支援できるアプリケーション スペシャリストがいます。
フィード濃度の小さな微調整が UF プロセス全体をどれほど変えることができるか、どれだけ強調してもしすぎることはありません。これは退屈な詳細ではありません。収量とスケジュールの目標をすべて達成する実行と、何日もトラブルシューティングを行って製品とコストを無駄にする実行の違いです。私たちが構築したのは、カセット限外濾過ラインは柔軟であり、さまざまな MWCO 用のオプションを備えています (当社のような30kd 限外濾過カセットそして500KD 限外濾過カセット)、フラット シート デザイン、TFF シリーズ セットアップなど、すべてのクライアントのフィードが異なることを私たちは知っているためです。飼料濃度の問題に悩んでいる場合、または単に UF プロセスをより効率的にしたい場合は、私たちがお手伝いいたします。私たちは濃度ウィンドウを適切に設定するために何千ものクライアントと協力してきました。そして、お客様にも同じことを行うことができます。飼料濃度などの小さな原因で実行が台無しにならないように、プロセスの最適化について今すぐ当社のチームに問い合わせてください。
参考文献
- ベルフォート、G.、デービス、RH、およびジドニー、アラバマ州 (1994)。クロスフロー精密ろ過における懸濁液と高分子溶液の挙動。膜科学ジャーナル、96(1–2)、1–58。
- Charcosset、C. (2007)。限外濾過における流体力学および濃度分極: レビュー。脱塩、211(1–3)、108–122。
- アラバマ州ジドニー (2018)。バイオ医薬品処理用のタンジェンシャルフローろ過。化学工学における最新の意見、20、109–115。
- モルダー、M. (1996)。膜技術の基本原理 (第 2 版)。クルーワー学術出版社。