限外ろ過チューブ使用上の注意

（1）適切な限外ろ過チューブを選択します。 一般的に、保持される分子量は、標的タンパク質の分子量の1/3を超えてはなりません。 例えば、標的タンパク質の分子量が35kDaの場合、分子量が10kDaの限外ろ過チューブを選択できます。 標的タンパク質の分子量が約10kdの場合、分子量3KDの限外ろ過チューブを使用できます。 取扱説明書を注意深く読み、さまざまな化学物質に対する限外ろ過膜の耐性の違いに注意してください。

（2）新しく購入した限外ろ過は乾燥しています。 使用前に超純水を加えると、水は完全に膜を通過します。 氷浴または冷蔵庫で数分間予冷します。 次に、水を注ぎ、タンパク質溶液を追加します。 添加量は、チューブ上部の白い線を超えてはなりません。 操作は軽くする必要があります。 タンパク質溶液を加える前に、限外濾過チューブを氷上に挿入して予冷する必要があります。

（3）バランス。 質量と重心の両方のバランスをとる必要があります。 速度と加速は速すぎてはいけないことに注意してください。速すぎないと、限外ろ過膜が直接損傷します。 遠心限外ろ過を開始します（4度に予冷する遠心分離機）。 異なる遠心分離機のRPMがGに変換された後、それは異なります。 遠心分離機の加速度を最も低いギアに調整して、膜への圧力を減らします。 遠心分離機を離れる前に、遠心分離機が目標速度に達するまで待つ必要があることに注意してください。そうしないと、遠心分離機に問題がある場合、最初はそれに対処できません。 メンブレンと回転シャフトの方向は、指示に従って調整する必要があります（角度回転遠心分離機の場合、メンブレンはシャフトに対して垂直です）。 実際の使用では、速度は一般的にマニュアルよりも遅く、遠心パイプの耐用年数を延ばすことができます。

（4）残りの1mlに濃縮したら、50ulの緩衝液を加え、10ulを加えて青色に変わるかどうかを確認し、限外ろ過チューブからタンパク質が漏れているかどうかを判断します。 チューブに漏れがある場合は、上層を注ぎ、新しいチューブに流して限外ろ過を開始します。 チューブが漏れているかどうかを正確に判断するには、5mgmlのBSAで10分間遠心分離し、フロースルーし、タンパク質接着剤またはブラッドフォードを実行して大まかな測定を行い、残りのタンパク質溶液を加えて濃縮します（タンパク質がなくなるのを防ぐために氷上で操作します加熱）すべての濃縮溶液が追加されるまで。 遠心分離中にタンパク質の沈殿が起こり、パイプが詰まるかどうかに注意してください。 沈殿が発生した場合は、タンパク質濃度が高すぎるか、バッファーが不適切かなど、沈殿の具体的な原因を特定します。 前者は、濃度を下げるために複数の限外ろ過チューブで同時に限外ろ過することで解決できます。 後者は、タンパク質が沈殿しなくなるまで異なる緩衝液を交換することです。

（5）前のステップは、タンパク質を濃縮するために使用されます。 緩衝液を交換したい場合は、総タンパク質溶液が約1mlに濃縮されたら、新しい緩衝液を静かに加え（0 .22um限外濾過膜による限外濾過）、次に約1mlに3回連続して濃縮します。 最終濃度の最終容量は、必要なタンパク質濃度に依存します。これは通常500ul以下ですが、200ul未満に濃縮することもできます。 毎回10回以上の体積分率によると、3回で1000倍以上に達する可能性があり、基本的にはバッファー交換の目的を達成することができます。