組み換え大腸菌の高密度発酵溶解液の清澄化プロセスに関する研究
クロマトグラフィーへの物質流体の干渉を減らし、標的タンパク質の回収率を向上させるために、2つの組み換え大腸菌株の高密度発酵溶解物の清澄化プロセスを研究した。Streptococcus suisとHaemophilus parasuisの主要遺伝子を発現する株BL21-HP1036とBL21-palAが選択された。タンジェンシャルフロープロセス、高速遠心分離プロセス、膜カセット清澄化プロセスを使用して、濁度と電気泳動検出によってタンパク質収量を評価した。
結果は、Streptococcus suisおよびHaemophilus parasuisの主要遺伝子を発現するBL21-HP1036、BL21-palA高密度発酵溶解物が膜カセットろ過および遠心分離によって清澄化され、タンパク質収率が80％を超え、クロマトグラフィー干渉を効果的に低減し、回収率を向上させることができることを示しました。
導入
現在、豚農場で最も一般的な細菌性疾患病原体は、Streptococcus suis（SS）とHaemophilus parasuis（HPS）であり、養豚業界に多大な損失をもたらしています。SSは合計35の血清型1-34と1/2に分類され、HPSは1-15の血清型に分類され、両者はしばしば混合され、主に豚多発性漿膜炎、関節炎、髄膜炎、心内膜炎、細菌性敗血症、気管支炎を引き起こします。
Streptococcus suis と Haemophilus parasuis の血清型数が多いため、異なる血清型間の交差防御が弱く、抗生物質で治療すると抗生物質耐性が大幅に増加し、治療効果に影響を与えます。
ワクチンはSSとHPSを予防する有効な手段の一つとなっている。不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、生ワクチン、サブユニットワクチン、遺伝子組み換えワクチンなどがあるが、市場に出回っているのは主に不活化ワクチンと弱毒化ワクチンであり、免疫防御力は優れているが、交差防御力は明らかではない。サブユニットワクチンは、連鎖球菌に対する新しいタイプのワクチンであり、交差防御力が強く、価格が安い新しいタイプのワクチンである。連鎖球菌とヘモフィルス・パラスイスのサブユニットワクチンの研究開発は、中国の養豚業界を悩ませている連鎖球菌とヘモフィルス・パラスイスの予防と制御の問題に完璧な解決策を提供している。
Streptococcus suis および Haemophilus parasuis サブユニットワクチンは、組み換え大腸菌による高密度発酵にかけられます。溶解液の清澄化は、ターゲットタンパク質の収量に大きな影響を与えますが、関連する報告はほとんどありません。発酵精製プロセスの清澄化ステップをどのように実現するかは重要な作業です。本稿では、組み換え大腸菌 BL21-HP1036、BL21-palA 高密度発酵を対象として、清澄化溶液の濁度を効率的に低減し、タンパク質収量を向上させる方法を研究し、Streptococcus suis サブユニットワクチン発酵プロセスの工業的粉砕および清澄化技術を実現するための理論的根拠と技術的サポートを提供します。
1. 材料と方法
1.1 材料
1.1.1 系統
ストレプトコッカス スイスおよびヘモフィルス パラスイス株 BL21-HP1036、BL21-pa-lA
1.1.2 主な培地と試薬
酵母エキスおよびイルカ、塩化ナトリウム、カナマイシン、IPTG、ホルムアルデヒド、SDS-PAGE ゲルキット。
1.1.3 主な試験装置
高密度発酵槽、高速遠心分離機、電気泳動装置、紫外線ゲルイメージングシステム、超音波粉砕機、小型高速遠心分離機、紫外線分光光度計、恒温振盪テーブル、アフィニティークロマトグラフィー装置。
1.2 方法
1.2.1 高密度発酵培養
適格な組み換え大腸菌株BL21-HP1036およびBL21-pa-lAを合成培地に2%(V/V)で接種し、37度で35-40時間培養した。
1.2.2 組み換えタンパク質誘導発現
発酵溶液のODが{{0}}±0.1になったとき、誘導が始まり、誘導温度は35度±0.5度で、10時間の誘導後に培養を終了しました。
1.2.3 高圧均一粉砕および遠心分離
不活化試験に合格した菌液を、高圧ホモジナイザーで100～150MPaの圧力で破砕し、細胞破砕を行った。破砕後、破砕液を低温で保存した。
遠心速度：15000rpm、温度制御：10度〜15度、注入速度：0.5〜1L /分の条件で高速遠心分離機により上清を得て、上清を収集し、上清をエンドトキシンを除去した容器に充填した。
1.2.4 精密濾過膜カセットによる清澄化
膜を10Lの精製水で一方向で洗浄し、接線流濾過を行った。遠心分離後の破砕細菌懸濁液300mLをパイプライン遠心分離機から取り出し、0.45umの精密濾過膜カセットで清澄化した。それぞれサンプリングして濁度を測定し、遠心分離後の濁度、精密濾過膜カセット内の清澄液の濁度、精密濾過膜カセット内の濃縮液の濁度を比較した。サンプルのタンパク質含有量をクロマトグラフィーと電気泳動で検出し、タンパク質収量を評価した。
ステップ2: 結果
2.1 BL21-HP1036およびBL21-palAタンパク質の解明データと試験結果
図1の結果は、チューブ遠心分離後、BL21-HP1036およびBL21-palA組換え大腸菌粉砕液の濁度が、それぞれ4 500 NTUおよび4 000 NTUから1970 NTUおよび520 NTUに減少したことを示しています。BL21-HP1036およびBL21-palA組換え大腸菌の濁度は、精密濾過膜カセット法によって25 NTUおよび1.28 NTUに減少しました。精密濾過膜カセット接線流濾過および最適化されたオープンフローチャネルの使用は、従来の遠心濾過よりもクロマトグラフィー液のエンドトキシン、粘度および濁度の低減に優れた効果があり、破壊された組換え大腸菌ヘテロタンパク質および核酸を大幅に低減できることが分かります。
2.2 BL21-HP1036およびBL21-palAサンプルのタンパク質回収
表1は、組換え大腸菌BL21-HP1036タンパク質が精密濾過膜で覆われた精密濾過清澄液と濃縮上清の両方に存在し、精密濾過清澄液と濃縮上清からタンパク質を回収した後の総タンパク質収率は約88.5％であることを示しています。BL21-palAタンパク質も精密濾過滲出液清澄液と精密濾過膜カセットで覆われた濃縮液の上清に存在しました。BL21-PALaタンパク質の総収率は81.5％でした。
3. 結論
本論文では、それぞれStreptococcus suisとHaemophilus parasuisのキー遺伝子BL{{0}}HP1036とBL21-palAを発現する株を高密度発酵させ、0.45 umの精密濾過膜カセットプロセスによって材料液の濁度が大幅に低下したことから、精密濾過膜カセットを使用した接線流濾過技術は高速遠心分離機を使用した技術よりも優れており、破壊された組み換え大腸菌の不純物タンパク質と核酸を大幅に削減できることが示されました。
単一の精密濾過膜カセットに清澄液を採取した後、62.9% BL21-HP1036 の標的タンパク質の 37.1% が精密濾過濃縮物であったり、精密濾過膜カセットやその他の損失に存在していたりしたため、清澄化のために 2 段階法を採用しました。第 1 段階では、0.45um の精密濾過膜カセットを使用して滲出液を清澄化して採取し、第 2 段階では、残りの濃縮液をチューブ遠心分離後に採取し、2 段階で清澄化した液をクロマトグラフィー サンプルとして組み合わせました。BL21-palA 発酵液の濁度値は大幅に増加せず、タンパク質収率は 85.5% 以上に達し、BL21-Pala 発酵液のタンパク質収率は 2 段階処理後に 81.5% に達しました。
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