天然コラーゲン抽出における限外濾過の応用

天然タンパク質資源であるコラーゲンは、良好な生体適合性、低抗原性、生分解性および止血性、緻密ならせん構造および独自の特性を備えており、これらすべてが工業化の前提条件となります。 コラーゲンとその副産物は、包装材や化粧品、ヘルスケア製品としてだけでなく、食肉製品を改良するための食品添加物としても使用され、特に医療分野で重要な役割を果たしています。

 

コラーゲンとは?

 

コラーゲンは生物学的高分子であり、動物の結合組織の主成分であり、哺乳類で最も豊富で広く分布している機能タンパク質であり、総タンパク質の 25% ～ 30% を占め、一部の生物では最大 80% 以上を占めます。 動物細胞において組織を結合する役割を果たします。

成人の体内には約3kgのコラーゲンが存在すると測定されており、主に人間の皮膚、骨、目、歯、腱、内臓（心臓、胃、腸、血管など）および人体の他の部分に存在しており、皮膚や組織、臓器の形態や構造を維持する機能があり、損傷後のさまざまな組織を修復するための重要な原料でもあります。

 

コラーゲンタンパク質には多くの種類があり、一般的なタイプは I 型、II 型、III 型、V 型、および XI 型です。 コラーゲンは、その優れた生体適合性、生分解性、生理活性により、食品、医療、組織工学、化粧品などの分野で広く使用されています。

天然コラーゲンの抽出方法

家畜や家禽の動物組織は、人々が天然コラーゲンとそのコラーゲンペプチドを入手する主な方法です。 しかし、関連する動物の病気や特定の宗教的信念のため、人々による陸上哺乳類のコラーゲンとその製品の利用は制限されており、その開発は徐々に海洋生物に向けられつつあります。 欧州食品安全機関（EFSA）は、動物の骨由来のコラーゲンであっても狂牛病やその他の関連疾患に感染する可能性がないことを確認しました。 水生動物、特に皮膚、骨、鱗などの加工廃棄物に多く含まれるコラーゲンは、アミノ酸組成や架橋度の違いにより、家畜のコラーゲンにはない多くの利点を持っています。 さらに、海洋動物由来のコラーゲンは、抗原性やアレルギー誘発性が低いなど、いくつかの点で陸上動物由来のコラーゲンより明らかに優れています。 したがって、水生コラーゲンは徐々に陸生動物コラーゲンに取って代わられる可能性があります。 ソウギョの魚の鱗からコラーゲンを抽出するプロセスを例として挙げました。

 

限外濾過法によるソウギョの鱗からのコラーゲンの抽出

1. 材料と方法

1.1 テストサンプル

粗コラーゲン水抽出物。

1.2 試験方法

1.2.1 限外濾過処理ルート

 

1.2.2 前濾過プロセスの決定

このテストでは、真空濾過法と精密濾過法を比較分析して、最適なプレ濾過濾過プロセスを決定します。 具体的な試験方法は以下の通りです。

① 粗コラーゲン水抽出物を濾紙を真空ポンプで濾過し、水抽出物中の浮遊粒子や不純物を除去しました。

②粗コラーゲン水抽出物を0.2μmの精密ろ過膜でろ過し、水抽出物中の不溶物や不純物を除去しました。

 

1.2.3 限外濾過膜の孔径の選択

限外濾過膜の孔径は１００ｋＤａであった。

 

1.2.4 限外濾過精製プロセスの単一要素実験

限外濾過技術を使用して粗コラーゲン水抽出物を精製し、操作圧力、操作温度、pH 値がコラーゲン保持力に及ぼす影響に関する単一要素実験を研究しました。 限外濾過装置を一定期間起動して安定させた後、コラーゲン保持に対するさまざまな要因の影響を研究しました。

 

1.2.5 計算式

 

2. 結果と分析

2.1 前濾過工程の分析結果

真空抽出と精密ろ過の 2 つのろ過方法の比較結果を次の表に示します。

 

表から、真空濾過法と精密濾過法の両方が溶液中の不純物や不溶性固体を除去できることがわかりますが、精密濾過法の方がタンパク質に対する保護効果が優れており、損失が明らかではなく、真空濾過法の方が優れています。タンパク質の損失を引き起こしやすくなります。 また、真空濾過法では濾液を一定期間放置すると濁りが現れますが、精密濾過液はまだ透明で透明であるため、限外濾過の前処理プロセスとして精密濾過が選択されます。

 

2.2 限外濾過プロセスの単一因子試験

2.2.1 限外濾過圧力が保持率に及ぼす影響

温度40度、pH=9.0の条件下では、異なる限外濾過圧力（0.07MPa、{{9}）の影響}.09MPa、0.11MPa、0.13MPa、0.15MPa)のタンパク質保持力を研究しました。 結果を下の図に示します。

上図からわかるように、操作圧力の上昇に伴いタンパク質保持率は徐々に低下します。 使用圧力が{{0}}.07MPaの場合、タンパク質保持率は96.53%、使用圧力0.15MPaの場合、タンパク質保持率は84.38%です。 これは、限外濾過の物質の分離効果が圧力差によって行われるためです。 低い操作圧力の範囲では、小さな分子はすぐに膜を通過できますが、大きな分子は限外濾過膜によって捕捉され、膜表面に蓄積する可能性があります。 このとき、膜表面と抽出水との間に濃度差が生じ、濃度分極抵抗が生じます。 このときの圧力は比較的低いため、定着率に大きな影響を与えることはありません。 しかし、圧力が上昇すると濃度分極抵抗が徐々に増加し、膜表面と水抽出液の濃度差が平衡に達します。 圧力がこの平衡を超えると、膜表面にゲル層が形成される可能性があり（これは、限外濾過中に濃度分極と凝縮層が形成されるという理論と一致します）、圧力が増加し続けると、ゲル層の厚さが増加しますとなり、膜表面に残るタンパク質も増加します。 その結果、定着率が低下してしまいます。 膜の分離効果を確実にするための最適な作動圧力パラメータは0.07MPaです。

 

2.2.2 タンパク質保持に対する温度の影響

{{0}.11MPaの圧力とpH=9.0の条件下で、異なる温度、すなわち25度、30度、35度、40度、45度がタンパク質に及ぼす影響保持力が研究されました。 結果を下の図に示します。

上図からわかるように、限外ろ過膜の保持率は温度の上昇とともに徐々に増加し、45℃で最大保持率97.01%に達します。 これは、コラーゲンの粘度が温度と密接に関係しているためです。 温度が低いとコラーゲンの粘度が大きくなり、膜表面にコラーゲンが蓄積して抵抗が生じやすくなり、保持率が低下します。 温度が上昇すると、コラーゲンの粘度が低下し、コラーゲン分子間の相互作用が弱まり、物質移動速度が増加し、濃度分極現象が弱まり、保持率が増加します。 保持率が上昇するもう一つの理由は、温度が上昇し、それに応じてコラーゲンの溶解度も増加し、コラーゲンが膜をブロックする現象が減少するため、限外濾過の最適温度は45度です。

 

2.2.3 タンパク質保持に対する pH 値の影響

{{0}.11MPaの圧力と40度の温度の条件下では、異なるpH条件、すなわちpH=6.0、pH{{ 5}}.{{10}}、pH=8.0、pH=9.0、および pH=10.0 の保持率に関する研究が行われました。 結果を下の図に示します。

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>図７に示すように、ｐＨ値の増加に伴って保持率は徐々に増加する。 これは、限外濾過膜がマイナス電荷を持ったポリエーテルメープル膜であり、アルカリ条件下ではコラーゲンがマイナスに帯電するためです。 マイナスに帯電したコラーゲン分子は、同じ電荷を持つ限外濾過膜と相互に排他的な状態を形成するため、膜表面に留まりにくく膜を閉塞します。 したがって、限外濾過の最適 pH 値は 8-10 です。

 

2.3 限外濾過プロセスの最適化と結果の検証

Design-Expert8.05 ソフトウェアの分析によると、最適なプロセス パラメーターは次のとおりです: 動作圧力 0.14MPa、動作温度 40.98 度、溶液 pH{{7 }}.43、保持率は 92.551% です。 実際のパラメータの操作性を考慮して、限外ろ過条件は操作圧力 0.14MPa、操作温度 40 度、原料液の pH 値 9.50 を選択し、限外ろ過システムが起動して安定した後に試験検証を開始しました。 保持率の結果は(92.61±0.1)%(n=3)でした。 方程式の予測値は基本的に測定値と同様であり、予測された条件パラメーターの結果が実際の条件の結果と一致していることを示しています。

 

2.4 電気泳動分析結果

精製したコラーゲンを SDS-PAGE 電気泳動で分析した結果を次の図に示します。

 

上の図からわかるように、レーン 1 はこのテストの精製コラーゲン、レーン 2 はふくらはぎ腱の標準コラーゲン サンプルです。 SDS-PAGE電気泳動により、今回のコラーゲンはコラーゲンであることが確認できましたが、a1ペプチド鎖とa2ペプチド鎖の境界は明確ではないようです。 電気泳動マップから他のタンパク質の不純物がないことがわかり、精製されたコラーゲンは純度が高いと結論付けることができます。

ガイドリングについて

 

Guidling Technology は、バイオ医薬品、細胞培養、生物医学の精製と濃縮、診断および工業用流体に重点を置いている国家ハイテク企業です。 当社は、バイオ医薬品、細胞培養などのアプリケーションシナリオに完全に適合する遠心濾過装置、限外濾過および精密濾過カセット、ウイルスフィルター、TFFシステム、デプスフィルター、中空糸などの開発に成功してきました。 当社のメンブレンおよびメンブレンフィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過などの濃縮、抽出、分離に広く使用されています。 小型の使い捨て実験室用ろ過から生産用ろ過システム、無菌試験、発酵、細胞培養などに至るまで、当社の多くの製品ラインは、試験と生産のニーズを満たします。 Guidling Technology はあなたとの協力を楽しみにしています!