の適用U濾過Eの抽出N自然なCコラーゲン

 

Ⅰ.コラーゲンとは

コラーゲンは生体高分子であり、動物の結合組織の主成分であり、哺乳類で最も豊富で広く分布している機能性タンパク質でもあり、全タンパク質の 25% ～ 30% を占め、一部の動物では最大 80% 以上を占めます。生物。 動物細胞において組織を結合する役割を果たします。

測定によると、成人の体内には約3kgのコラーゲンが存在しており、主に皮膚、骨、目、歯、腱、内臓（心臓、胃、腸、血管など）などに存在しています。人間の体の。 その機能は皮膚や臓器の形態や構造を維持することであり、損傷した組織を修復するための重要な原料でもあります。

II. 限外濾過によるソウギョ鱗からのコラーゲンの抽出

1. 材料と方法

1.1 テストサンプル

粗コラーゲンの水性抽出物。

1.2 試験方法

1.2.1 限外濾過プロセス

1.2.2 前濾過工程の決定

このテストでは、真空ろ過法と精密ろ過法の比較分析を通じて、最適な前ろ過プロセスを決定します。 具体的な試験方法は以下の通りです。

① 粗コラーゲン水抽出液を濾紙真空濾過法により濾過し、水抽出液中の浮遊粒子や不純物を除去します。

② 粗コラーゲン水抽出液を0.2μmの精密濾過膜で濾過し、水抽出液中の不溶物や不純物等を除去します。

1.2.3 限外濾過膜の孔径の選択

精製中の限外濾過膜の孔径は 100 kDa です。

1.2.4 限外濾過精製プロセスの単一要素実験

粗コラーゲンの水性抽出物は、限外濾過技術によって精製されます。 操作圧力、操作温度、pH がコラーゲン保持力に及ぼす影響の単一因子実験を研究します。 限外濾過装置を一定期間起動した後、コラーゲン保持率に対するさまざまな要因の影響を研究します。

1.2.5 計算式

2. 結果と分析

2.1 前濾過プロセスの分析

減圧ろ過法と精密ろ過法の比較結果は下表を参照してください。

ろ過方法	濾過前の溶液濃度/(g/L)	ろ過後の溶液濃度/(g/L)	感覚現象
真空濾過法	0.45	0.35	濾過終了時には溶液は透明ですが、一定期間放置すると白濁します。
精密濾過法	0.45	0.42	溶液は濾過終了時には透明で、一定期間放置した後も透明なままです。

 

表から、真空濾過法と精密濾過法の両方が溶液中の不純物や不溶性固体を除去できることがわかりますが、精密濾過法の方がタンパク質に対する保護効果が優れており、損失は大きくありません。真空濾過法ではタンパク質が失われる可能性があります。 また、減圧濾過では一定時間放置すると濾液が白濁しますが、精密濾過ではまだ透明なため、限外濾過の前処理工程として精密濾過が選択されます。

2.2 限外濾過プロセスの単一因子試験

2.2.1 限外濾過圧力が保持率に及ぼす影響

温度 40 度、pH 9.0 の条件下で、さまざまな限外濾過圧力 (0.07MPa、0.{) の影響を研究します。 {11}}9MPa、0.11MPa、0.13MPa、0.15MPa）タンパク質保持率。 結果を下の図に示します。

 

上図からわかるように、操作圧力の増加に伴い、タンパク質の遮断率は徐々に低下しました。 {{0}.07MPaではタンパク質保持率は96.53%、使用圧力0.15MPaではタンパク質保持率は84.38%です。 それは、限外濾過による物質の分離が圧力差によって行われるためです。 このような低い操作圧力の範囲では、低分子物質はすぐに膜を通過できますが、高分子物質は限外濾過膜によって捕捉されて膜の表面に蓄積する可能性があり、現時点では膜の表面と水層に堆積します。濃度差を抽出して濃度差分極抵抗を生じさせる。 しかし、圧力が増加すると、濃度分​​極抵抗が徐々に増加し、膜表面と水抽出物の濃度差が平衡に達します。 圧力がこの平衡を超えると、膜表面にゲル層が書き込まれる可能性があります（これは、限外濾過中に形成される濃度分極およびゲル層の理論と一致しました）。 圧力が上昇し続けるとゲル層の厚みが増し、膜表面に残るタンパク質が増加して保持率が低下します。 膜の分離効果を確実にするために、最適な操作圧力パラメーターは 0.07MPa です。

2.2.2 タンパク質保持率に対する温度の影響

圧力{{0}.11MPa、pH9.0の条件下で、さまざまな温度(25度、30度、35度、40度、45度)がタンパク質の保持に及ぼす影響を研究します。 結果を下の図に示します。

 

上図に示すように、限外濾過膜の保持率は温度の上昇とともに徐々に増加し、45℃で最大となり、保持率は97.01%となります。 コラーゲンの粘度は温度と密接な関係があるため、温度が低いとコラーゲンの粘度が大きくなり、膜表面にコラーゲンが抵抗を形成しやすくなり、保持率が低下します。 温度が上昇すると、コラーゲンの粘度が低下し、コラーゲン分子間の相互作用が弱まるため、物質移動速度が増加し、濃度分極が弱まり、保持率が増加します。 保持率が向上するもう一つの理由は、温度が上昇し、それに伴ってコラーゲンの溶解度が増加し、コラーゲンが膜を詰まらせる現象が減少することである。 したがって、限外濾過の最適温度は 45 度です。

2.2.3 タンパク質保持に対する pH の影響

圧力 {{0}.11MPa、温度 40 度の条件下で、さまざまな pH 条件、つまり pH=6.0、pH{ {5}}.{{10}}、pH=8.0、pH=9.0、pH=10.0、保持率。 結果を下の図に示します。

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>図７に示すように、ｐＨの増加に伴って保持率は徐々に増加する。 これは、限外濾過膜がマイナス電荷を持ったポリエーテルメープル膜であり、アルカリ条件下ではマイナス電荷を帯びたコラーゲンが存在し、マイナス電荷を帯びたコラーゲン分子と同じ電荷を持った限外濾過膜が相互に排他的な状態を形成し、コラーゲン分子が表面に留まりにくいためです。膜の詰まりは容易ではないため、限外濾過の最適 pH は 8-10 です。

2.3 限外濾過プロセスの最適化と結果の検証

Design-Expert8.05 ソフトウェアによる分析によると、最適なプロセス パラメーターは次のとおりです: 動作圧力 0.14MPa、動作温度 40.98 度、溶液 pH=9.43。 この条件下での保持率は 92.551% でした。 実際のパラメータの操作性を考慮して、限外濾過条件での操作圧力は0.14MPa、操作温度は40度、供給液のpH値は9.50です。 実験検証は、限外濾過装置のシステムが安定して起動した後に開始されます。 取得された保持率の結果は (92.61 0.1)% (n=3) です。 方程式の予測値は基本的に測定値と同様であり、これは、予測された条件パラメータの結果が実際の条件結果と一致していることを示しています。

2.4 電気泳動分析結果

精製したコラーゲンをSDS-PAGE電気泳動で分析した結果を下図に示します。

上図に示すように、レーン 1 はこの実験で使用した精製コラーゲン、レーン 2 はふくらはぎ腱の標準コラーゲン サンプルです。 SDS-PAGE電気泳動により、今回の実験で提案したコラーゲンタンパク質はコラーゲンであることが確認できましたが、一見不明瞭なa1ペプチド鎖とa2ペプチド鎖の境界は明確ではありません。 電気泳動により他のタンパク質のバンドがないことが明らかであり、精製コラーゲンの純度は高いと結論付けることができます。