包接体精製における中空糸のいくつかのユニークな方法の簡単な説明
封入体 (IB) は、外来遺伝子が原核細胞、特に大腸菌で発現するときに形成される膜に包まれた高密度の不溶性タンパク質粒子です。 IB は顕微鏡で観察すると、細胞質内の他の成分とは明らかに異なる高屈折領域です。
封入体の形成は細胞質でのタンパク質生成速度に関連し、比較的複雑であり、新たに生成されるペプチドの濃度が高く、非晶質タンパク質凝集体を形成するために折りたたむのに十分な時間がありません。封入体は基本的にタンパク質で構成されており、その 50% 以上がクローン生成物です。これらの製品の一次構造は完全に正しいですが、三次元構成が間違っているため、生物学的活性はありません。封入体のサイズは0.5-1μmで、水に不溶で、尿素、塩酸グアニジンなどの変性剤にのみ溶解します。
大腸菌では、封入体は細胞の 2 つの場所、細胞質と周辺細胞質に発生する可能性があります。細胞内の封入体の位置と特性は、タンパク質がどのように発現されるかによって異なります。
大腸菌の細胞質内の封入体の直径は一般に{{0}}.2～1.5μmの範囲であり、インターフェロンのサイズは0.811μm、インターフェロンのサイズは0.811μmなど、タンパク質によって直径も異なります。プロレンネットは1.281μmです。場合によっては、封入体の直径が大腸菌の直径より大きく、大腸菌に突起が生じる場合があります。一般に、細胞には封入体が 1 つだけあります。
封入体の精製
封入体の精製プロセスは一般的に次のとおりです。
細胞の破砕:
細胞破砕の一般的な技術としては、高速組織破砕、ガラスホモジナイザーによる均質化、超音波処理、凍結融解繰り返し法、化学的処理（一般にリゾチーム処理が使用される）などが挙げられる。
包接体の洗浄：
封入体は、細菌によって発現されたタンパク質の細胞内凝集によって形成される不活性な固体粒子であり、通常は非晶質で不溶性の形態で存在します。封入体では、真の目的タンパク質は約 50% のみを占め、残りには脂質、リポ多糖、核酸、ヘテロタンパク質が含まれており、これらは封入体に結合して封入体タンパク質の再生に影響を与えます。したがって、変性前の洗浄は非常に必要なステップです。
さらに、封入体の洗浄は、組換えタンパク質のリフォールディング収量を増加させるのに役立ちます。不純物を除去することで、再生プロセスの障害が軽減され、タンパク質がより効率的に折りたたまれ、正しく組み立てられるようになり、タンパク質の活性と機能が向上します。
洗浄には通常、1% 未満の中性洗剤 (Tween、Triton、尿素、NP40 など) と EDTA および還元剤 2- メルカプトトレイトール (DTT)、メルカプトエタノールを何度も使用します。これは、洗剤の洗浄能力が向上するためです。溶液のイオン強度が増加するため、封入体の洗浄時にNaClを添加してイオン強度を増加させることができます。
封入体は、遠心分離または濾過によって細胞破壊溶液の他の成分を除去するために使用できます。どちらも封入体の異なる物理的特性を利用しています。
遠心分離:
封入体タンパク質は、同じ体積の細胞断片よりもはるかに密度が高いため、遠心分離によって封入体を細胞の残りの部分から分離できます。連続遠心分離は、工業生産において封入体を得るために最も頻繁に使用される操作です。細胞断片の密度は封入体に比べて小さいため、沈降速度は封入体に比べて小さい。連続的な懸濁と遠心分離により、封入体の大部分を遠心分離することができ、細胞断片は徐々に除去されます。
ろ過（タンジェンシャルフローろ過）：封入体と可溶性タンパク質の分子サイズが異なるため、ろ過方法を使用できるため、運用コストが削減され、スケールアップが容易になります。タンジェンシャルフローろ過 (TFF) は膜間差圧によって駆動されます。膜の孔径より小さい物質や不純物は膜を通過しますが、粒子の大きい細胞などの不純物は捕捉されます。一般的にろ過洗浄に使用される膜口径は0.1μmです。中空糸接線流精密ろ過は、液体材料の高固形分を直接処理でき、手順が少なく、操作が簡単で、膜は洗浄を通じて繰り返し使用できるため、モジュール式自動生産の要件に沿って、設備投資と運用コストが削減されます。
以下はGuidling中空糸カラムを用いた封入体洗浄の応用例です。
94cm2 0.1-0.45μmの中空糸を使用し、250mLの液体（目的タンパク質の分子量17kd）を濃縮しました。洗浄プロセス全体において、標的タンパク質の回収率と膜フラックスの減少を調査しました。
0-71分は濃縮プロセス、71-224分は洗浄と濾過のプロセスです。精密ろ過プロセス全体を通じて、TMP は徐々に増加し、液体入口速度は変化せず、平均材料流束は 12LMH でした。
その結果、標的タンパク質は完全に捕捉され、標的タンパク質の回収率は90%以上であることがわかりました。ガイド中空糸カラムは安定しており、この用途に適しています。
封入体の溶解:
封入体は通常、変性剤尿素または塩酸グアニジンの条件下で溶解され、溶解した封入体タンパク質は完全に変性されます。つまり、一次構造と共有結合を除いて保持され、すべての水素結合と疎水性結合が破壊され、疎水性になります。側鎖が完全に露出しています。
尿素と塩酸グアニジンは中程度の強度の変性剤であり、透析や限外濾過によって容易に除去されます。一般的な尿素濃度は8-10M、塩酸グアニジンは6-8Mです。尿素溶解は、非イオン化、中性、低コスト、再生後のタンパク質の除去により多量のタンパク質の沈殿が生じない、溶解した封入体はさまざまなクロマトグラフィー法で精製できるなどの利点があり、広く使用されています。 。
封入体タンパク質のリフォールディング:
機能的なタンパク質を形成するには、溶解した組換えタンパク質が正しく折りたたまれなければなりません。再生技術には、タンパク質溶液を中性付近まで希釈すること、変性剤の除去、カラムでの再生、およびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれます。中でも、タンパク質溶液を中性付近に希釈して変性剤を除去するというのは古典的な再生方法として一般的であり、特に希釈再生法が最も高い利用率を誇っています。
変性剤の除去:
透析：体積が増加せず、外部透過液の濃度を徐々に下げることで変性剤の除去速度を制御する利点があるが、時間がかかり、不活性なタンパク質凝集体を形成しやすいため、透析には適さない大規模な運用のため、生産規模には適用できません。
限外濾過 (TFF) : 研究開発、パイロットテスト、製造のいずれにおいても、透析速度の制御が容易で、限外濾過 (TFF) を通じて変性剤 (液体の変化 + 濃縮) を除去できます。
封入体タンパク質の精製:
再生後のタンパク質の精製方法は、可溶性タンパク質の精製方法、すなわちイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析沈殿などと同様です。
封入体には生物学的活性がなく、タンパク質活性の損失を心配する必要がなく、大量の発現によって細胞死が引き起こされることはなく、プロテアーゼ攻撃に対する耐性が最大化されます。 Jiuling 中空糸は封入体の下流精製プロセスに柔軟に適用できます。封入体の洗浄工程では、遠心洗浄と比較して優れた性能を発揮し、接線流濾過洗浄に九年技術精密濾過中空糸を使用することで、処理時間を大幅に短縮でき、一般的な回収率は90％以上に達します。 Jiuling 中空糸は封入体のタンパク質再生ステップにも使用できます。精密ろ過中空糸でろ過された供給液の濁度は大幅に低減され、タンパク質の回収率が高くなります。限外濾過中空糸を使用すると、変性剤を除去できるだけでなく、クロマトグラフィーサンプルのローディング時間を短縮できるため、時間を節約し、充填剤の量を減らし、製造コストを削減できます。精密濾過/限外濾過中空糸の回収率は材料によって異なり、一般的な回収率は 90-95% に達することがあります。
Guidling Technology は、関連するレビューのためのテスト キットのリクエストを歓迎します。
ガイドリングについて
Guidling Technology は、バイオ医薬品、細胞培養、生物医学の精製と濃縮、診断および工業用流体に重点を置いている国家ハイテク企業です。当社は、バイオ医薬品、細胞培養などのアプリケーションシナリオに完全に適合する遠心濾過装置、限外濾過および精密濾過カセット、ウイルスフィルター、TFFシステム、デプスフィルター、中空糸などの開発に成功してきました。当社のメンブレンおよびメンブレンフィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過などの濃縮、抽出、分離に広く使用されています。小型の使い捨て実験室用ろ過から生産用ろ過システム、無菌試験、発酵、細胞培養などに至るまで、当社の多くの製品ラインは、試験と生産のニーズを満たします。 Guidling Technology はあなたとの協力を楽しみにしています!