適切な限外ろ過チューブの選び方

タンパク質の濃縮やバッファーの交換に一般的に使用される限外ろ過チューブは、限外ろ過チューブでよく使用されます。 標的タンパク質の分子量、濃縮前の体積、および濃縮の標的体積に応じて、異なる体積サイズおよび限外濾過チューブを有する他のモデルがあります。 再利用可能。

1.主にMWCOと濃度容量を考慮して、適切な限外ろ過チューブを選択します。 一般的に、分子量は標的タンパク質の分子量の1/3を超えてはなりません。 標的タンパク質の分子量が約10kdの場合、分子量が3KDに保たれた限外ろ過チューブを使用できます。

2.新しく購入した限外ろ過は乾燥しています。 使用前にミリク水を​​追加してください。 水は膜を完全に通過し、氷浴または冷蔵庫で数分間予冷されます。 次に、水を注ぎ、タンパク質溶液を加えます。 タンパク質溶液の量は、試験管上部の白い線を超えてはなりません。 簡単操作。 タンパク質溶液を加える前に、限外濾過チューブを氷に挿入して予冷する必要があります。

3.バランス。 質量と重心のバランスをとる必要があります。 速度と加速は速すぎてはいけないことに注意してください。速すぎないと、限外ろ過膜が直接損傷します。 遠心限外ろ過を開始します（遠心分離機を4度に予冷します）。 ダイヤフラムと回転シャフトの方向は、指示に従って調整できます（角度遠心分離機の場合、ダイヤフラムはシャフトに垂直です）。 実際の使用では、一般的な速度はマニュアルで指定されている速度よりも遅く、遠心パイプの寿命を延ばす可能性があります。

4.残りの1mlに濃縮したら、[50ulの家庭用ブラッドフォード溶液を取り、10ulの液体を加えて青色に変わるかどうかを確認し、限外ろ過チューブがタンパク質を漏らしていないかどうかを確認します。 チューブが漏れた場合は、それを上層に注ぎ、新しいチューブに戻して限外ろ過を開始します。 試験管が漏れているかどうかを正確に判断するには、5mg 10分遠心分離10分してから通過させ、プロテインゲルまたはブラッドフォードを実行します][粗測定]。 すべての濃縮溶液が追加されるまで、濃縮する残りのタンパク質溶液を追加し続けます（タンパク質の加熱を防ぐために氷上で操作します）。 遠心分離中は、タンパク質の沈殿が起こり、チューブが詰まるかどうかに注意してください。 沈殿が発生した場合は、タンパク質濃度が高すぎるか、バッファーが不適切かなど、沈殿の具体的な原因を特定してください。 前者は複数の限外ろ過チューブを同時に使用して濃度を下げることで解決できますが、後者はタンパク質が沈殿するまで異なるバッファーを交換できます。

5.前のステップは、タンパク質を濃縮するために使用されます。 バッファーを交換する場合は、総タンパク質溶液が約1mlに濃縮されたら、新しいバッファーを静かに加え（0 .22um限外濾過膜による限外濾過）、次に約1mlに3回連続して濃縮します。最終濃度は必要なタンパク質濃度に依存し、通常は500ul以下または200ul未満です。 毎回10回以上の体積分率によると、3回の1000倍以上であり、基本的にバッファー交換の目的を達成することができます。

6.最終的なタンパク質濃縮物を取り除きます。 氷上で操作します。 黄色のピペットチップ（200ul）を使用して、ピペットチップを端に沿って静かに挿入し、タンパク質溶液を静かに吹き付けて混合します。 限外ろ過膜に触れないように注意してください。 完全に吸引されるまで、濃縮溶液を毎回200ulに吸引します。 試験管の底で最後に濃縮された溶液を抽出する必要はありません。そうしないと、難しすぎて限外ろ過膜が損傷する可能性があります。 最後に、ミリク水が限外ろ過膜を通過せずに限外ろ過チューブに追加され、水分の損失と膜の乾燥を防ぎます。

7.限外ろ過チューブを処理し、限外ろ過チューブを再利用するための手順は次のとおりです。

8.限外ろ過チューブに水を注ぎ、ミリク水で数回穏やかにすすぎます。 [試験管の底に明らかなタンパク質の沈殿がある場合は、最初に水を追加してから、ピペットで吹き飛ばすことができます。 メンブレンに触れないように注意してください。 堆積物は垂れ下がってから逃げます。 水道水で洗い流すことはできません。 0 .2m NaOH溶液を加えた後、室温で20分間置き、この間に限外ろ過チューブのバランスを取ります。 さらに10分間遠心します。 残りのNaOH溶液を注ぎ、綿の芯をビーカー（1または2L）のミリク水に浸し、数時間置いてから、新しい水と交換し、数時間置いて、NaOHの濃度を継続的に希釈します。 50mlの試験管とカバーを水道水で洗い、内壁をミリク水で洗います。

9.浸漬した試験管コアを取り出し、それを完全なミリク水に加えてから、50mlの試験管にミリク水を​​入れます。 チューブコアをゆっくりと50mlに入れます。

チューブを遠心分離し、水を排出して分割し、次に使用するまで4度で覆って保管します。 一般的に言えば、上記の手順と注意事項によれば、各チューブは3〜4年以内に破損することはありません。