文献共有|複雑な浄化に別れを告げますか？新しいTFF +界面活性剤法は、効率を改善し、AAVベクター生産のコストを削減します

遺伝子治療は急速に発達していますが、その高コストは、より広範な患者へのアクセスを防ぐ大きな障壁のままです。このコストの主要な要因の中には、Adeno -関連ウイルス（AAV）ベクトルの複雑な生産プロセスがあります。 Biotechnology and Bioengineeringに掲載された研究では、接線方向の流れろ過（TFF）と界面活性剤を組み合わせた新しい精製方法を開発しました。これは、AAV精製プロセスを簡素化し、コストを削減することを約束します。東京大学のチームが率いるこの研究を掘り下げましょう。

 

1。研究の背景：AAV浄化の課題と現在の状況

AAVベクターは、安全性が高い、免疫原性が低く、分裂と非-分割細胞の両方に感染する能力、および-項の遺伝子発現の容量があるため、遺伝子治療の「星」送達ツールになりました。しかし、それらの生産プロセスは複雑であり、特に下流の精製ステップは通常、複数のラウンドの遠心分離とクロマトグラフィーを伴います。これらの方法は、時間-消費、労働力-集中的で、拡張が困難で、費用がかかります。

実験室規模では、精製はしばしば塩化セシウムまたはイオジキサノール密度勾配の超遠心分離に依存しており、これは工業生産の規模を拡大するのが困難です。アフィニティクロマトグラフィーがますます使用されていますが、必要な低pH溶出条件はウイルス感染を損なう可能性があります。したがって、シンプルで効率的で、穏やかで、スケーラブルなAAV精製方法を開発することが重要です。

接線流ろ過（TFF）は、濃縮およびバッファー-バイオプロダクチを交換するために一般的に使用されるサイズ-ベースの分離技術です。ただし、従来のTFFは、AAV精製中に宿主細胞タンパク質（HCP）やDNAなどの不純物を除去する能力が限られており、しばしばタンパク質凝集体を置き去りにします。

 

2。革新的なアプローチ：効率的な浄化のために界面活性剤と組み合わせたTFF

伝統的なTFFの限界を克服するために、研究者のリミ・ミヤカ、Yuji Tsunekawa、および東京大学の同僚は、賢い戦略を考案しました：界面活性剤を使用して不純物タンパク質の凝集と相互作用を阻害し、TFFの超炎症膜（500 KDA分子型）を通過させることができます（500 KDA分子分子膜（500 KDA） サイズ）。

彼らは3種類の界面活性剤をテストしました。

• non - ionic：オクチルグルコシド
• アニオン性：デオキシコレートナトリウム
• ZWITITIONIC：チャップス

この研究では、非-イオン界面活性剤のみを使用することは効果がないことがわかりました。アニオン性デオキシコレートナトリウムとZwitheric Chapsの両方が、残留タンパク質の除去を大幅に促進し、異なるタンパク質集団を標的としました。最終的に、0.5％のデオキシコレートと1％Chapsを組み合わせると、顕著な結果が生じ、ほぼ完全に残留宿主タンパク質が排除されました。 SDS -ページ分析は、3つの透明なAAV CapSIDタンパク質バンド（VP1/VP2/VP3）のみを示しました。

 

図1。界面活性剤のないTFF精製プロセス。（a）SDS -ページゲル電気泳動; （b）透過型電子顕微鏡（TEM）

 

図1。界面活性剤によるTFF精製プロセス。（a）SDS -ページジェル電気泳動;（b）透過型電子顕微鏡（TEM）

 

3。研究結果：高純度、活動、安全性

1. 効率的な不純物除去：新しい方法では、HCPの99.98％除去とDNAの95％除去を達成し、アフィニティクロマトグラフィーの純度に匹敵するか、それを超える純度を超えました。
2. 感染性の向上：in vitro実験により、AAV1ベクターは、この方法に感染したHEK293細胞を使用して精製したことが示されました。これは、アフィニティクロマトグラフィー（24.9％対20.8％）で精製された細胞よりも効率的であり、ウイルスの生物活性のより良い保存を示しています。
3. in vivoの安全性：マウスの骨格筋に精製されたAAV1ベクターを局所注射した後、2週間後に有意な炎症や組織の損傷は観察されず、in vivoの安全性が示されました。
4. 広範な血清型の適用性：このメソッドは、AAV1、AAV5、AAV8、およびAAV9-FR-FR CELL CELL CULTURE UPERINATANTSを含む複数の血清型-を正常に精製しました。ただし、主に高不純物負荷の細胞溶解物に存在するAAV2の場合、さらなる最適化が必要です。

 

4。概要と見通し

この研究は、シンプルで迅速な（1.5時間）、効率的で、スケーラブルな新しいAAV精製プロセスを開発しました。デオキシコレートとチャップスを組み合わせることにより、TFF精製中の残留タンパク質凝集の課題に成功しました。

方法の利点は次のとおりです。

• 過酷な低pH条件を避け、ウイルス活動をより良く保存します
• クロマトグラフィーの手順を削減し、ワークフローを簡素化し、時間とコストを節約する
• 簡単にスケーラブルで、産業用大規模-スケール生産に適しています
• エキソソーム、他のウイルス、組換え抗体などの他の生体染色体を精製するための新しい戦略を提供する

現在の制限には、最適下のウイルス回復と完全なウイルス粒子から空のカプシドを分離できないことが含まれます。その最良の使用は、マルチ-ステップ精製ワークフローでの最初の-ステップキャプチャとしてである可能性があることを示唆しています。

結論として、この研究は、下流のAAVベクター生産のための魅力的な新しいオプションを提供し、遺伝子治療薬のコストを大幅に削減し、幅広いアプリケーションを促進する可能性があります。