まとめ：

この記事では、タンパク質精製戦略で考慮しなければならない2つの重要な要因をレビューします：ダウンストリームアプリケーション要件とタンパク質自体の生物学的特性。この記事は、高品質のタンパク質精製が、特に組換えタンパク質の生産のための実験データの信頼性と再現性の基礎であることを強調しています。さまざまなアプリケーションシナリオには、タンパク質の純度、活性、またはエンドトキシン含有量に特定の要件があり、タンパク質の特性は精製戦略に大きく影響する可能性があります。特定のケースによると、この記事は、一意のタンパク質がカスタマイズされた精製スキームを採用すべきであることを示しています。最後に、系統的なタンパク質生産プロセスが提案され（図1）、発現システムの選択、建設設計から精製の最適化までのフルプロセスの品質制御が強調され、生物物理学的技術（SECマル、DSFなど）を通じてタンパク質の均一性と機能の評価を推奨しました。この記事の目的は、研究者に実用的なガイダンスを提供し、標的タンパク質の特性と応用要件に基づいて効率的かつ繰り返し可能な精製戦略を策定し、それによって科学研究の品質と効率を高めることを目的としています。

 

図1。タンパク質生産プロセスの概略図

 

高需要タンパク質生産 - 問題識別の例、緩和戦略の設計、および対応する出力

 

1.タンパク質への核酸結合：

核酸結合タンパク質を精製する場合、核酸汚染を除去するには複数のステップが必要です。溶解中、ヌクレアーゼ（SMヌクレアーゼ（Benzonase®）またはDNaseまたはRNaseなど）を追加する必要がありますが、結合した核酸を完全に除去することはできません。 PEIまたは硫酸ストレプトマイシンなどの核酸除去ステップ、ヘパリン精製、またはイオン交換クロマトグラフィーなど。核酸の存在は、精製プロセス全体でA26 0 nm\/a28 0 nmの比率で監視されました。比率が0.6未満の場合、タンパク質の純度が比較的高く、核酸汚染が最小限であることを示しました。強く結合した核酸を伴うタンパク質の場合、それらは一時的に変性し（尿素で処理したなど）、その後再尿をかけることができます。キーポイント：高品質の試薬、新鮮なバッファー、クリーンカラムを使用します（使用前に0.5m NAOHでクリーン）。

 

2。マウスフェリチン重鎖：

精製されたマウスフェリチン重鎖（MFTH1）タンパク質を生成する目的は、高解像度の単一粒子クライオエレクトロン顕微鏡（CRYO-EM）です。ヌクレアーゼを添加せずに、無標識MFTH1をエンコードした無標識MFTH1をエンコードしたMFTH1は超音波的に破壊されました。 7 0度で加熱した後、硫酸アンモニウムの沈殿、透析、サイズの除外クロマトグラフィーのステップを受けました。得られたサンプルは、クライオエレクトロン顕微鏡画像に大量の汚染物質が存在することを示しました（図2A）。これは、その適用には完全に不適切でした。手順を最適化します。細胞溶解プロセス中にSMヌクレアーゼを加え、硫酸アンモニウム沈殿後の透析プロセスを加え、アニオン交換クロマトグラフィーステップを追加して、A26 0 NM\/A280NMの比率を1.4から0.8に減らします。後の除外クロマトグラフィー後、最終MFTH1サンプルのA260NM\/A280NMの比率は0.56でした。 SDS-PAGEおよびCRYO-ELECTRON顕微鏡画像（図2B）は、タンパク質が非常に純粋であることを示し、汚染物質が効果的に除去されたことを示しています。

図2マウスフェリチン重鎖

 

 

 

3.キメラタンパク質ヒトDSRBEC（DSRBD-EGF-キメラ）：

DSRBECは、ヒトプロテインキナーゼRおよびヒト表皮成長因子（HEGF）の二本鎖RNA結合ドメイン（DSRBD）の融合によって形成されます。 DSRBDが大腸菌で発現すると、非常に高いDSRNA結合能力が示されます。細胞溶解後、汚染RNAは、固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC）カラムへの組換えタンパク質の結合を妨げます。 PEIやStreptomycin硫酸塩などの従来の方法、RNase処理、高塩緩衝液溶液はRNAを除去できません。細胞溶解は、4M尿素を含むバッファーを使用して実行されました。上清をiMac列に積み込み、4mから0 m尿素を一晩ゆっくり使用しました（列の再測定）。再生緩衝液をイミダゾールで加え、iMacカラムから溶出しました。最終的な改良は、機能的に活性なDSRBECを得るために、SuperDex 75ゲルろ過を介して実行されました。

 

4。二価カチオンまたは他の補因子に結合したタンパク質：

Zn {2+、Fe 2+、cu 2+、または他の補因子などの二重のカチオンと相互作用するタンパク質の場合、発現中に特定の二重カチオン（または他の補因子）を追加することが重要です。精製プロセス中に、同じ二価カチオン（または他の補因子）も必要です。ただし、キレート剤（EDTA、EGTAなど）の使用およびキレート還元剤（DTTやDTEなど）は回避する必要があります。二価カチオンに結合したタンパク質を扱う場合、キレート化剤のないプロテアーゼ阻害剤の混合物を使用して、分光法（または原子吸収分光光度測定など）を通じて精製タンパク質における二価カチオン（または他の補因子）の実際の存在を確認する必要があります。

 

5。熱化性シアノバクテリアマスチゴクラドス椎頭腫からの単一の[2FE±2s]クラスターを含む組換えフェリドキシン（RFD）

フェリドキシンは、電子移動反応に関与する可溶性鉄硫黄タンパク質です。植物型フェロードキシンは、光化学系Iの電子受容体として単一の[2FE±2S]クラスターを搭載しています。Escherichiacoli BL21（DE3）株は、10mm FECL3および抗生物質を含むTB培地で組換えRFDタンパク質を発現しました。 IMACキャプチャカラムの溶出は、イミダゾールを避け、[2FE±2S]クラスターの破壊を防ぐために、10mmヒスチジンを含むバッファーを使用して実行されました。アニオン交換とサイズの除外クロマトグラフィーを使用して、結晶化スクリーニングのためにさらに精製し、12mg\/mlに濃度を濃縮しました。フェロードキシンの組換え産生と比較して、青緑色の藻類の甲状腺類層から精製された天然フェロードキシンは、結晶化中に高分解能を達成しました。

 

6。抗原として使用されるタンパク質

タンパク質は、標的固有のリガンドを回復するための抗原としてよく使用されます。最初に考慮すべきことは、タンパク質がin vivo免疫が従来のモノクローナルまたはポリクローナルIgGを得るために使用されるか、ラクダIgGまたはin vitro選択プロセスを含むプログラムで使用されるかです。

 

6.1日常的な抗体産生に使用される抗原

モノクローナル抗体の正しい折り畳みは通常、モノクローナル抗体の正しい折り畳みは必要ありません。これは、ほとんどのモノクローナル抗体が抗原の構造によって大きく影響を受けない線形エピトープを認識し、変性抗原（包含体タンパクなど）が有効なままであるため、抗原の正しい折りたたみは必要ありません。ただし、免疫応答を妨害し、非標的抗体の優位性を引き起こす強力な免疫原性汚染物質を避けるために、純度を厳密に制御する必要があります。

 

6.2コンジュゲートライブラリのスクリーニング

ラクダの予防接種によって得られたナノボディライブラリーの処理中に、抗原の自然な立体構造を維持することに特に注意が払われるべきです。従来の抗体とは異なり、ラクダ抗体（特にナノボディ）は構造エピトープを認識する傾向があり、これは独自の凸補体部位構造に関連しています。同様に、in vitroで大規模な合成または天然抗体ライブラリーをスクリーニングする場合、抗原は標的用途と完全に一致する構造を維持する必要があります。スクリーニングプロセス自体は偏りがないため、抗原が誤って折り畳まれ、凝集または立体構造の不均一性がある場合、非自然のエピトープを標的とする多数のコンジュゲートがスクリーニングされる可能性があります。

 

 

 

7。分子間または分子内ジスルフィド結合または遊離システインを含むタンパク質

タンパク質の自然構造を安定化するには、ジスルフィド結合が重要です。精製プロセス中に、分子間または分子内ジスルフィド結合を含むタンパク質を精製する場合、還元剤を追加してタンパク質の立体構造変化を防ぎ、それによりその機能を変化させる必要があります。遊離システインを含むタンパク質の場合、人工ジスルフィド結合の形成を防ぐために、特に貯蔵中、精製プロセスのすべてのステップで減少剤が不可欠です。最も一般的に使用される還元剤は、ジチオトレイトール（DTT）、 - メルカプトエタノール（-ME）、およびトリス（2-カルボキシエチル）塩酸ホスフィン（TCEP）です。 DTTまたはTCEPと互換性のないIMAC樹脂の場合、-MEを使用して、後続のステップで他の還元剤に置き換えることをお勧めします。

 

8。組換え抗体断片

組換え抗体断片の構造（ナノボディなど）はIgGの構造よりも単純ですが、その機能はジスルフィド結合の正しい形成に依存します。細菌発現システムでは、最適化戦略が採用されていても、可溶性または包含体の両方に存在する誤って折り畳まれた製品または部分的に折り畳まれた製品が依然として発生する可能性があります。より隠されているのは、正しく折りたたまれた抗体断片でさえ、表面の疎水性プラークを介して可溶性凝集体（コロイド凝集）を形成する可能性があることです。このような凝集体は、多価結合がモノマーの親和性の低下を隠す可能性があるため、日常的な機能テスト（ELISAなど）で識別することは困難ですが、それらの存在は小分子サイズ（超分解顕微鏡など）に依存するアプリケーションに深刻な影響を与える可能性があります。したがって、SDS-PAGEのみに依存することは、サンプル品質を評価するには不十分です。ゲルろ過などの生物物理学的方法（図3）を採用して、モノマー（主なピーク）と凝集体（除外体積ピーク）を区別する必要があります。重要な制御ポイントには、発現中に酸化還元環境を最適化してジスルフィド結合形成を促進し、凝集を防ぐために浄化後の貯蔵条件を最適化します。これらの測定は、抗体断片の単分裂性と機能を確保するために重要です。

図3。ナノボディの可溶性凝集体のゲルろ過分離

 

9。リンパ球受容体LLT1の可溶性断片

ジスルフィド結合依存性タンパク質（リンパ球受容体LLT1など）の組換え発現は、しばしば折り畳みの困難に直面します。野生型LLT1のゲルろ過は、凝集ピークと二量体のピークを示したが（図4a）、質量分析により、二量体の対応のないシステインによって引き起こされるミス折りたたみが明らかになった（図4B）。この目的のために、2つの変異体が設計されました。1つはシステインの問題を除去し、降伏の突然の減少をもたらしました（図4a）。適合したジスルフィド結合を再構築するためのネオシスタインの導入後、変異体は高収量と良好な安定性を持っているだけでなく、結晶化する可能性があり（図4C）、3D構造により、変異体が正しいジスルフィド結合を形成し、自然な折りたたみが維持されることが確認されました。この症例は、ゲルろ過と質量分析分析と組み合わせて、コンフォーマルジスルフィド結合を合理的に設計することにより、組換えタンパク質の折り畳み問題を効果的に解決し、安定した構造と高収量を備えた機能性タンパク質を得ることができることを示しています。

図4。ジスルフィド結合の再構築により、可溶性LLT1の折りたたみと収率が改善されます

 

 

 

10。簡単に凝集しやすいタンパク質

組換えタンパク質の精製はしばしば凝集の問題に直面し、その形成は「核形成成長」メカニズムに従います - 少量の可溶性凝集体が最初に形成され、次に大規模な不溶性凝集を引き起こします。この課題に対処するには、マルチレベルの戦略を採用する必要があります。発現段階では、株を最適化し、培養培地または異なる溶解性融合タンパク質を使用して培養温度を下げ、発現システム（昆虫\/哺乳類細胞）を置き換えることで達成できます。 SECからIMAC）を採用して、凝集核を迅速に除去する必要があります。一般的に、バッファ溶液をスクリーニングする場合、成分組成、pH値、解離剤、または溶解剤などの要因を考慮する必要があります（図5）。直交検出（SEC、CD、LS、DSF、蛍光熱に基づいた温度シフトなど）の細かい最適化により、タンパク質の品質と最も適切なバッファー溶液が決定されました。

図5。タンパク質凝集を緩和するための戦略

 

11。ヒトCLK1キナーゼの結晶化（再現可能なバッチを得る方法）

結晶化研究のために均一な非リン酸化CLK1キナーゼを取得するために、多発性共同制度が採用されました。第一に、自己リン酸化の不均一性を排除するために、大腸菌のλ-ホスファターゼと共発現しました。収量は減少しましたが、完全な脱リン酸化が確保されました。 IMACによる捕獲後、溶離剤に凝集を防ぐために安定剤（50mmアルギニン、50mmグルタミン酸、10mm DTT）を補充し、濃縮し、彼のタグをTEV消化により除去しました。次に、正しいオリゴマーをSEC（5％グリセロールと-MEを含む）で分離しました。最終的な重要な陰イオン交換ステップは、結晶（非リン酸化）と非結晶（部分的にリン酸化された）CLK1基を区別します。細胞溶解のモードがタンパク質の安定性に大きく影響することは特に注目に値します - 高圧および高温法は、CLK1の不可逆的な凝集につながり、キナーゼ調製のための軽度の治療の重要性を強調しています。

 

 

 

12。安定したリガンド結合能力を備えたガレクチン-1を生産します

リガンド結合研究のために機能的ガレクチン-1を調製するために、4つの構成要素の発現と精製戦略（非標識および彼の標識野生型ガレクチン-1、非標識および彼の標識なしのシステインを含まない変異体ガレクチン-1）を比較しました。重要な調査結果は、乳糖アフィニティクロマトグラフィーの精製が正しく折りたたまれたタンパク質を効果的にスクリーニングできることを示していますが、結合部位から乳糖を完全に除去してCRD活性を回復するために、徹底的な透析（HEPESバッファー）と組み合わせる必要があります。野生型ガレクチン-1は、酸化と不活性化を起こしやすく、還元剤の存在下でもその安定性は限られたままです（図6）。しかし、システインを含まない変異体は、ジスルフィド結合依存を排除​​することにより、同等の凝集活動と熱安定性（Nanodsf、ITCなどで検証）を維持しながら、長期の安定性を大幅に向上させます。

図6。組換えガレクチン-1の流体力学的特性評価は、その不安定性を明らかにしています

 

13。エンドトキシン除去

エンドトキシン除去方法は、正の帯電クロマトグラフィー（アニオン交換）、ポリ型リガンド（ポリ-L-リジン（PLL）（PLL）などのポリアミン（ポリミキシンB）など）の使用、および界面活性剤トリトンX -114の添加など、アフィニティクロマトグラフィーに基づいています。精製プロセス中に、LPSのない水でバッファ溶液を準備することに注意し、他のLPSのない浄化でのみ使用されている新しい列または柱を使用します。エンドトキシン汚染の場合、クロマトグラフィーポンプ\/流体システムは、0。5MNaOHまたは1。0 M naOHで4時間0。サンプル内のLPSの最終量は、Limulus Amebocyte Lysate Reagent（LAL）を使用して評価され、特定の用途に必要な制限を下回っているかどうかが確認されました。

 

14。タンパク質複合体

タンパク質複合体の発現と精製は、特定の条件に応じて最適化する必要があります。課題には、サブユニットの不安定性またはミスフォールディングが含まれます。各サブユニットは、独立して発現し、in vitroで組み立てられるか、共発現して機能性タンパク質複合体を形成することができます。特に複雑な情報が制限され、複数の最適化が必要な場合は、アセンブリへの干渉を避けるために、浄化または検出ラベルで慎重に導入する必要があります。精製プロセス中、複合体の完全性と安定性を評価する必要があります。この方法には、SDS-PAGE（サブユニット検出）、SEC（均一性）、SECマルス（モル質量分析）、質量測光または天然質量分析（質量検証）が含まれます。複合体は低濃度で解離する可能性があることに注意する必要があります。現時点では、クロマトグラフィー法またはバッファー（サーマルドリフトやDSFスクリーニング条件など）を最適化する必要があります。さらに、浄化ステップを減らすと、相互作用サブユニットが弱い損失を防ぎ、浄化効率と複合体の完全性のバランスをとることができます。

 

 

 

15。抗原抗体複合体の精製

抗体 - 抗原複合体は、タンパク質複合体の典型的な例です。それらの共結晶化は、結合パターンを明らかにし、抗体工学の最適化を導くことができます。従来の方法では、抗原と抗体の個別の精製が必要であり、それらを混合する必要があります。ただし、最近の研究では、共発現と共同編成戦略がより効率的であることが示されています。複合体を取得するには単一の精製のみが必要であり、同時に不安定な抗原を抗体を介して安定化することができ、標識のない発現さえも達成できます。この特定の状況では、SDS-PAGEおよびゲルろ過（SEC）は通常、複合体の純度と品質を評価するのに十分です。

 

まとめ

タンパク質精製は、科学研究における基本的な技術です。アカデミックスケールのタンパク質生産は通常、標準的な戦略に従い、構造生物学、生化学、機能研究で広く使用されているミリグラムレベルの高純度で可溶性タンパク質を生成できます。ただし、下流の用途の特別な要件（動物実験におけるエンドトキシンなし、核酸研究におけるヌクレアーゼ汚染の必要性など）またはタンパク質（ジスルフィド結合や高核酸親和性を含む容易な凝集など）の固有の特性は、しばしばカスタマイズされた溶液を必要とします。このレビューは、これらの特別な状況に応じて、表現システムの選択、構成要素の設計（ラベルとドメインの境界）の設計から浄化プロセスに至るまでの洗練された戦略を提案し、重要なステップで品質管理（SEC、SDS-PAGE、アクティビティ検出など）を導入します。一部のアプリケーションでは、バイオ医薬品産業の「品質保証」（QA）の概念、つまり体系的なプロセスによる欠陥を防ぐために、追加の分析（エンドトキシン検出や核酸残基の測定など）が必要です。品質管理ガイドラインを策定し、科学研究で使用されるタンパク質試薬の特定の基準を明確にすることにより、目的は、学術研究所のより厳密なタンパク質精製基準を確立し、実験データの信頼性と再現性を高め、基礎研究と産業基準の間のギャップを埋めることです。

 

doi：10.1186\/s 12934-022-01778-5