生産プロセスにおける生物学的製剤の安定性の問題と解決策
近年、バイオテクノロジー医薬品、特にモノクローナル医薬品が徐々に新薬の研究開発の主体になってきています。しかし、タンパク質バイオ医薬品は一般に複雑で不安定な構造、特に製造過程におけるさまざまな不安定因子により、バイオ医薬品の分解や不活化を引き起こすという問題を抱えています。生物学的製剤の調製プロセスは非常に複雑で、多くの場合、生合成（微生物発酵/細胞培養など）、ストックの精製と精製（クロマトグラフィー精製、ウイルス除去など）、および調製プロセス（調製構成、無菌濾過、充填、凍結など）を経ます。 -乾燥およびランプ検査）およびその他の生産、保管、輸送およびその他のリンク。したがって、これらの不安定性の問題を解決することが、生物学的医薬品の臨床応用を成功させる鍵となります。この記事では、生物学的医薬品の製造における分解方法を要約し、対応する解決策を提案しました。
生物技術（組換えDNA技術、リンパ球ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術など）やヒトゲノミクスの発展に伴い、バイオテクノロジー医薬品（生物医学、生物療法学、生物製剤、バイオ医薬品）、特にモノクローナル医薬品が徐々に主流になってきました。新薬の研究開発の分野。近年、世界の医療用医薬品の売れ筋トップ10のうち、バイオ医薬品が8割を占めており、医薬品分野全体に占める割合も年々増加しています。化学合成に基づく伝統的な小分子医薬品と比較して、生物学的医薬品は主にバイオテクノロジー手法、特に組換えDNA技術によって調製および生産されており、高活性、高特異性、低毒性という特徴があり、従来の小分子医薬品が解決できなかった多くの医療問題を解決します。薬では解決できないため、薬は命を救い、患者の生活の質を向上させる上でますます重要な役割を果たしています。
しかし、生物学的医薬品の開発は多くの技術的課題にも直面しています。まず、バイオ医薬品は非常に複雑な構造と成分を備えた生体高分子（相対分子量は通常 5x103 ～ 2x105）です。生物学的医薬品は通常、一次構造、つまりアミノ酸配列に加えて、生物学的活性の基礎となる複雑な高次構造（二次、三次、さらには四次構造など）を持っています。
同時に、翻訳後修飾、酵素による加水分解、化学分解などの要因により、一般的な生物学的医薬品は数百万以上の分子を含む非常に複雑な混合物になります。第二に、生物学的医薬品は不安定で、化学的および物理的に劣化しやすいです。化学的分解には共有結合の切断と形成が含まれますが、物理的分解は生物学的医薬品に特有のものであり、共有結合の変化は含まれませんが、主にタンパク質の高次構造の変化（疎水性表面への）物理的吸着、変性、解重合、凝集、沈殿。これらの分解は、その生物活性に影響を与えるだけでなく、多くの安全上の問題を引き起こす可能性があります。第二に、小分子医薬品とは異なり、ほとんどすべての生物学的医薬品には潜在的な免疫原性、つまり身体を刺激して特異的な抗体を形成したり、リンパ球を感作したりする能力があります。
生物学的製剤自体の構造に加えて、免疫原性は生物学的製剤の安定性とも密接に関係しており、特にポリマーやタンパク質粒子は身体を刺激して透明な医薬品に対応する抗体を形成しやすく、医薬品の有効性に影響を与えます。交差反応性によっても、人体の内因性タンパク質を中和する可能性があります。たとえば、ヒトエリスロポエチン（EprexR）治療を使用するときに生成される抗体は、タンパク質医薬品を中和するだけでなく、ヒト内因性タンパク質に結合してそれらを不活化し、その結果、患者に純粋な赤血球の再生障害が生じます。免疫反応は過敏反応を引き起こす可能性もあり、重篤な場合には患者の生命を危険にさらすこともあります。
生物学的医薬品の製造中に発生するいくつかの微妙な変化（構造など）は、製造プロセスまたは既存の分析技術による短期保存中に観察することが困難である可能性がありますが、長期保存プロセスの安定性に影響を与える可能性があるため、製品の最終品質に大きな影響を与えます。生産設備、原材料、梱包材の品質、従業員のトレーニングと運用も製品の品質に大きな影響を与えます。この記事では、製造プロセスにおける生物学的医薬品の安定性に影響を与える一般的な問題を要約し、対応する解決策を提案します。
01 生物学的製剤の調製プロセス
生物学的製剤の調製プロセスは非常に複雑です。生合成から臨床製剤への最終包装に至るまで、通常、生合成（微生物発酵/細胞培養など）、ストック精製、精製（クロマトグラフィー精製、ウイルス除去など）、調製などのさまざまな生産、保管、輸送のステップを経る必要があります。プロセス（準備構成、無菌濾過、充填、凍結乾燥、ランプ検査など）。最も一般的な抗体生物学的医薬品を例に挙げると、一般的な製造手順には次のステップが含まれます。 まず、細胞株を溶解し、適切な増殖環境で徐々に増殖させ、最終的に製造のニーズに対応します。
In the cell culture process, the environment of biologic medicines including cells, various proteolytic enzymes, nutrients and dissolved oxygen, etc., usually need to be maintained at a relatively high temperature (>十分なタンパク質合成と細胞外への分泌が完了するまで、30 度) および中性 pH 条件で 10 日間以上放置します。生物製剤合成後、不溶性の細胞残渣を遠心分離や濾過により除去し、生物製剤を含む上清をアフィニティープロテインAクロマトグラフィー（プロテインAクロマトグラフィー）、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーカラムで精製します。クロマトグラフィーによりウイルスが除去され、不活化されます。
精製後、生物製剤は限外濾過またはパーコレーションによって適切な緩衝液に置換され、医薬品原体に保存されるか、最終製剤成分に添加される場合には最終バルクの形で保存されます。最終製品は、別の内包材（容器蓋）に充填することにより得られ、さらに凍結乾燥処理により凍結乾燥粉末に調製されます。タンパク質は、製造プロセス全体を通じて、低 pH、高塩分、凍結融解、光、振動、せん断、さまざまな (疎水性) 表面などのさまざまな破壊的要因を受け、タンパク質の構造変化や分解を引き起こす可能性があります。生物製剤の品質に影響を与えるため、各ステップを最適化して、結果として生じる分解を回避または軽減できます。
02 微生物発酵・細胞培養における生物学的製剤の分解と制御
微生物の発酵・細胞培養プロセスは、それによって発現されるタンパク質医薬品の安定性に影響を与える可能性がありますが、微生物発酵・細胞培養プロセスにおける生物学的製剤の安定性に関する報告はほとんどなく、この問題は十分に注目されていません。この現象の主な理由は、微生物発酵 L 細胞培養のプロセスにおいて、微生物/細胞の増殖と発現量の適切な条件により多くの注意が払われ、一部の分解生成物は後の精製によって除去できること、または分解によるタンパク質の損失は、タンパク質の発現が不十分であることが原因であると考えられています。
生物学的医薬品開発の QbD 原則および FDA などの関連ガイドラインに従って、製品関連の不純物は生産の最前線で抑制され、その後精製およびその他のプロセスで除去されます。効果的な除去方法がない場合、不純物が医薬品の安全性と有効性に重大な影響を与えないことを証明する必要がありますが、これには多くの追加研究が必要となり、また、除去方法が不十分であるために不確実性が生じるリスクがあります。対象を絞った研究。したがって、推奨される戦略は、これらの劣化を根源から抑制することを検討することです。
微生物発酵/細胞培養中にタンパク質の分解を引き起こす要因は数多くあります。その 1 つは、高温、中性 pH、溶存酸素、塩イオン強度などの環境要因です。細胞培養の温度は通常の保管温度よりもはるかに高くなります。温度 (2 ～ 8 度など) で、ほとんどの化学反応と同様、温度が高いほどタンパク質の分解が速くなります。中性 pH では、モノクローナル抗体を含む多くのタンパク質が凝集や脱アミド化されやすくなります。溶存酸素濃度が低いと、タンパク質のジスルフィド結合対形成が不完全になる可能性があります。
さらに、金属イオン (銅イオンなど)、アミノ酸 (システインなど) などの培地の成分も、生物学的医薬品の品質、特にジスルフィド結合の形成と交換に影響を与えます。細胞培養条件を最適化するとタンパク質の安定性を向上させることができますが、どのプロセスも効果的かつ操作可能でなければなりません。多くのタンパク質の発現条件はタンパク質の安定性と矛盾する可能性があるため、特に微生物発酵/細胞培養条件の変化は、標的タンパク質の発現レベル、細胞増殖、プロセス関連不純物、およびグリコシル化レベルに影響を与える可能性があります。この際、総合的な検討と最適化を行う必要がある。
03 精製および除菌・脱ウイルス時の生化学物質の分解と制御
3.1 精製
The purification process is usually used to remove impurities and improve the purity of the medicine, but the conditions of some purification processes are relatively intense and the protein may be degraded. For example, protein A affinity chromatography used to purify monoclonal antibodies usually requires elution under acidic conditions (such as pH 3 to 4), however, some monoclonal antibodies are sensitive to acid, resulting in reduced or lost biologic activity. For example, the anti-CD52 monoclonal antibody alemtu-zumab (Campath) aggregated in >プロテインAクロマトグラフィーによる精製後は25%。これらの酸感受性タンパク質の場合、溶出時間を最小限に抑える必要があり、溶出後に適時に中和するか、より低い温度で溶出する必要があります。さらに、最適化された緩衝系 (アルギニンの添加など) を使用すると、凝集の生成を大幅に抑制し、抗体の回収率を向上させることができます。
イオン交換クロマトグラフィーでは、多くの場合、より高濃度の塩 (塩化ナトリウムや酢酸ナトリウムなど) を使用し、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーに適した溶液の pH を調整する必要がありますが、これらの条件が適切に行われるようにする必要があります。タンパク質の品質には影響しません。一部のモノクローナル抗体は高塩に対してより感受性が高く、乳白色や粒子などのタンパク質凝集体を形成する傾向があります。私たちは、高塩の代わりに緩衝液としてヒスチジンを使用した溶出が、そのような凝集反応を効果的に阻害できることを発見しました（データは公表されていません）。
疎水交換クロマトグラフィーでは、タンパク質は疎水基と移動相の間の親和性によって分離され、疎水性表面に容易に吸着されて変性します。ただし、有機溶媒を使用してタンパク質を溶出する必要がある逆相クロマトグラフィーよりもはるかに穏やかです。タンパク質の回収率を向上させるために、サンプル溶液または移動相にアルギニンを添加する方法も使用できます。
3.2 ウイルスの滅菌・除去
生物学的製剤は注射経路で投与する必要があるため、主に物理的除去と化学的不活化を含む滅菌とウイルス除去もバイオ医薬品に必要なプロセスです。物理的除去とは、物理的手段によって生物学的医薬品から細菌またはウイルスを分離することであり、主な方法は膜濾過/ナノ濾過およびクロマトグラフィーです。化学的不活化とは、主に界面活性剤の使用、加熱、酸処理、UV/Y 線処理などの化学的方法によって細菌やウイルスを不活化することです。
Sterilization by heat treatment means that the solution is heated to 60 ℃ for 10 h. When sterilizing by heat treatment, it is necessary to pay attention to whether the target protein can withstand the conditions. If the melting temperature (Tm) of human blood albumin is close to 60 ℃, it is generally necessary to add some protective agents, such as sodium caprylate and acetyltryptophan, to raise the Tm to >熱処理滅菌前は70度。同時に、一部の雑多なタンパク質、特に融解温度の低い微量の雑多なタンパク質の影響にも注意を払う必要があり、これらの不純物の分解後に形成される粒子はタンパク質凝集の核形成サイトとなり、タンパク質の凝集が促進されます。標的タンパク質。溶液にスクロースが含まれる場合、スクロースは高温条件下で加水分解されてグルコースとフルクトースを形成する傾向があり、これら 2 つの還元糖がタンパク質の遊離アミノ基とメイラード反応を起こし、その結果、スクロースが分解されることも考慮する必要があります。生物学的医薬品。
放射線による滅菌を行う場合、フリーラジカルによるタンパク質の化学的・物理的分解に注意する必要があり、通常、タンパク質を保護するためにフリーラジカル捕捉剤を添加する必要があります。
3.3 凍結融解
凍結融解は、生物学的医薬品の製造において、製造工程の各段階での待機工程や拠点の変更・移動などに必要な工程であり、原液を長期保存する一般的な方法でもあります。 。また、完成品の輸送時や患者が自宅で使用する際にも、偶発的な凍結融解が発生する可能性があります。一部のタンパク質は、特に適切な保護剤が存在しない場合、凍結融解に非常に敏感であり、タンパク質の不活化を容易に引き起こす可能性があります。したがって、凍結融解実験も製剤処方のスクリーニングには不可欠な部分です。
タンパク質の凍結融解破壊のメカニズムは次のとおりです。まず、凍結中に形成される氷水表面はタンパク質変性の重要な原因であり、タンパク質はこれらの表面に吸着されて変性および凝集する傾向があります。第二に、凍結プロセス中に大量の水が氷になった後、残りの溶質とタンパク質自体の濃度が急激に増加し、タンパク質濃度が高くなるほど、分子間衝突が発生する可能性が高くなり、形成がより深刻になります。集約の。
タンパク質分解の反応機構に応じて、凍結融解によるタンパク質の分解を抑制する方法はいくつかあります。例えば、8番目の氷水剤(ポリソルベート20、ポリソルベート80など)は、氷水の表面による劣化を抑制します。熱力学的安定性 (タンパク質を自然な状態に保つこと) は、溶液の pH とイオン強度を調整し、賦形剤/保護剤を添加することによって増加します。
生物製剤ストックを長期保存する場合、通常、非常に低い運動性 (速度論的安定性) を確保するために、タンパク質を最大凍結濃縮物のガラス転移温度 (T') 以下に維持する必要があります。たとえば、保護剤としてスクロースを含むタンパク質溶液の場合、その T' は約 -30 度であるため、-40 度以下の温度に保つ必要があります。
凍結融解の速度も生物学的医薬品の安定性に影響します。凍結が遅すぎると、長時間高濃度の状態でタンパク質が分解されやすくなります。逆に、非常に速い条件（-80 度など）では、大量の氷水面が形成される可能性があり、これも表面による劣化を引き起こします。融解速度も非常に重要であり、融解が遅い（たとえば 4 度）と、氷水の表面で溶けた水の再結晶化によってさらなる損傷が引き起こされます。そのため、製造工程では流水を利用して溶解を促進するなど、凍結した製品をできるだけ速い速度で溶かすことが一般的に推奨されています。
さらに、凍結プロセス中に、氷の形成と溶解度の低下により、一部の溶質が結晶化します。最も典型的なのはリン酸ナトリウム緩衝液です。リン酸二水素ナトリウムと比較すると、リン酸二水素ナトリウムの溶解度は温度に非常に敏感で、低温条件では最初の沈殿が起こり、溶液の pH が最大 3 まで低下します。 4単位、この時点では酸に敏感なタンパク質は分解されやすいです。アポネオカルチノスタチンやブドウ球菌ヌクレアーゼなど、複数のサブユニット構造を持つ一部のタンパク質は、温度の低下に伴って連結サブユニットの疎水性作用が低下するため、低温変性を起こします。
3.4 濾過/限外濾過
タンパク質溶液の膜ろ過には、滅菌ろ過、ナノろ過、および限外ろ過/パーコレーションという 3 つの主なタイプがあります。殺菌濾過は主に不溶性粒子や細菌を除去するために使用され、通常は最終製品の充填前に使用されます。ナノ濾過は主にウイルスを除去するために使用されます。限外濾過/パーコレーションは、主に精製サンプルを最終調製物の緩衝液に置き換えて濃縮するために使用され、溶液のpHを調整するためにタンパク質溶液に強アルカリまたは強酸を直接添加したり、他の物質を添加したりすることを避けます。固体賦形剤は局所的な熱放出を引き起こし、タンパク質の安定性に影響を与える可能性があります。
しかし、膜濾過自体がタンパク質に何らかの影響を及ぼし、タンパク質と濾過膜との相互作用によって原液中のタンパク質の濃度が低下したり、タンパク質が変性したりする可能性があり、タンパク質濃度が低い医薬品ではより重大な影響が生じます。一般に、界面活性剤を添加することにより、タンパク質とフィルター膜の相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用を低減できます。さらに、一部の低品質フィルター自体が粒子を脱落させ、タンパク質凝集の核形成点となり、タンパク質の凝集を加速します。高品質のフィルター膜を選択することが重要です。
限外濾過プロセスではドナン効果も考慮する必要があります。ドナン効果とは、膜濾過プロセス中にポリマー（タンパク質高分子など）が膜に捕捉され、溶液中で逆の電荷をもつ電解質が電荷の相互引力によりポリマーの周囲にさらに集まることを意味します。限外濾過工程では濾過膜を完全に透過することができず、濃度が上昇します。従来の抗体は限外濾液中でプラスに帯電しているため、アニオン性電解質に抗体が豊富に含まれ、濃度が増加します。
一般に、初期の緩衝液濃度が低く、限外濾過後のタンパク質濃度が高いほど、ドーナン効果がより明白になり、緩衝液の pH に対する影響がより顕著になります。ヒスチジンを含む緩衝液を使用すると、限外濾過により抗体医薬が濃縮される際にpH値が上昇し、製剤のpH値が品質管理基準を超えて不合格となる場合があります。
04 最終製品調製過程における生物学的製剤の分解と管理
4.1 構成と混合
製造プロセスでは、関与する生物学的医薬品のサイズが大きいため、局所的なタンパク質または賦形剤の濃度が高すぎる、または溶液のpHやイオン強度の変化がタンパク質の変性を引き起こす可能性があるなど、調製構成と混合操作が非常に重要になります。または降水量。製造中の機械撹拌機の種類、サイズ、混合速度および時間は、生物学的製剤の安定性に影響を与える可能性があります。たとえば、混合速度が高すぎると、タンパク質の凝集が促進されます。したがって、均一な混合を達成することを前提として、これらのパラメータを可能な限り最適化する必要があります。
4.2 充填
生物製剤は充填プロセス中に変性や凝集を起こしやすく、主にポンププロセスで発生するせん断力や一部の沈殿物による劣化などの機械的力が原因です。ピストンポンプのステンレス鋼がいくつかのナノ粒子を沈殿させ、抗体凝集の核形成点となることが報告されています。充填プロセス中に発生する小さな気泡は、気液表面のタンパク質を変性させる可能性があり、小さな気泡が壊れたときにフリーラジカルや局所的な熱変化を生成し、タンパク質の変性を引き起こす可能性があります。
4.3 凍結乾燥
生物学的製剤は液体製剤を使用する傾向があります。これは、コスト、プロセスの簡素化、患者の利便性の観点から、液体製剤の方が凍結乾燥製剤に比べて大きな利点があるためです。ただし、一部のタンパク質は水溶液中で非常に不安定であるため、調製の最適化後に十分な安定性が達成されない場合は、凍結乾燥調製物の使用を検討する必要があります。凍結乾燥プロセスでは多くの破壊因子が形成されます。最初の破壊因子は、以前に詳しく説明した冷凍プロセスにおける破壊因子です。
さらに、タンパク質は乾燥条件下でも分解因子に遭遇する可能性があります。たとえば、タンパク質の表面の水和層はタンパク質の安定性にとって非常に重要です。ハーゲマン博士は、タンパク質の表面には約7％の水分が含まれており、これはタンパク質の構造を維持するために非常に重要であり、凍結乾燥後の水分含有量は一般に1％から2％の間であるため、水の役割を他の物質で置き換える必要があると提案しました。脱水症状中。したがって、適切な処方と凍結乾燥プロセスを選択することが非常に重要です。一般に、スクロースやトレハロースなどの二糖類は水素結合供与体として比較的効果的な役割を果たすことができるが、高分子化合物は立体効果により水代替品としての役割を効果的に果たせないと考えられている。
また、スクロースやトレハロースは、凍結乾燥水分含量の制御（1%～2%など）を前提として、高いTを有する非晶質粉末を形成することができるため、系全体を固体状態に維持することができ、長期保管中の物理的および化学的劣化を抑制します。しかし、ポリペプチド生物学的医薬品（グルカゴンなど）の場合、比較的固定された高次構造を持たないため、水素結合の役割を果たせないヒドロキシエチルスターチなどの高分子糖でも、海藻糖と同様に高い保護効果を発揮することができます。最近、新しい生物学的医薬品の凍結乾燥保護剤としてアミノ酸、特にアルギニンを単独で、またはスクロースと混合して使用すると、凍結および凍結乾燥条件下でタンパク質の安定性を保護するのに非常に効果的に使用できることが報告されています。
05 生物学的製剤の保管、輸送、使用中の分解と管理
タンパク質は、保管、輸送、使用の過程で、保管や輸送中の短期間の温度変化、輸送中の振動、輸送や使用中の光損傷など、さまざまな劣化条件も経験し、タンパク質の品質に大きな影響を与える可能性があります。 。バイオ医薬品やワクチンの場合、コールドチェーン輸送は製品の品質を確保するための重要な要素です。近年、中国では2010年の山西省ワクチン事件や2016年の山東省違法ワクチン事件など、ワクチンの安全性に関する事件が複数発生している。これらの事件はいずれもワクチンの不適切な保管と輸送に関係しており、ワクチンによって引き起こされる潜在的な医薬品の安全性リスクが含まれている。それらは社会全体の大きな懸念を引き起こした。したがって、保管、輸送、使用のプロセスにおける管理と制御を強化することは、生物学的医薬品の安全な適用を確保するための重要なつながりです。
06 まとめ
生物製剤は非常に壊れやすい分子であり、その製品の品質は製造プロセスと密接に関係しています。製造プロセスでは、さまざまな化学的および物理的劣化が発生しやすく、特に生物学的医薬品の高分子の物理的分解は、さまざまな物理的または機械的条件下で発生する可能性があるため、低分子医薬品の経験をそのまま生物学的医薬品に適用することはできません。
製造プロセスでは、撹拌速度が速すぎるミキサーで生物学的薬剤溶液を混合したり、溶液のpHを調整するために強酸やアルカリを直接使用したり、タンパク質溶液に固体賦形剤を直接添加したりするような極端な条件は避けるべきです。溶ける。短期的には検出可能な影響を引き起こさないかもしれませんが、生物学的製剤の局所的な正常な微細構造に影響を与えている可能性があり、これらの構造変化は長期保存中に増幅され、最終的に製品の品質に影響を与えます。
必要に応じて、ストックまたは最終製品に対して加速および強制劣化安定性試験を使用することで、さまざまな製造プロセスまたは保護剤の比較評価を迅速化できます。これらの分解生成物は最終製品に残り、最終的には患者に使用され、安全性、有効性、免疫原性の問題が生じるため、精製および充填中に特に注意を払う必要があります。
ある意味、バイオ医薬品の製造プロセスはその品質を決定します。そのためには、最終製品が安全かつ効果的に患者に適用されることを保証するために、これらの分子の分解メカニズムの分析と、製造プロセス全体を通じて起こり得る分解の抑制が必要です。
ガイドリングについて
Guidling Technology は、バイオ医薬品、細胞培養、生物医学の精製と濃縮、診断および工業用流体に重点を置いている国家ハイテク企業です。当社は、バイオ医薬品、細胞培養などのアプリケーションシナリオに完全に適合する遠心濾過装置、限外濾過および精密濾過カセット、ウイルスフィルター、TFFシステム、デプスフィルター、中空糸などの開発に成功してきました。当社のメンブレンおよびメンブレンフィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過などの濃縮、抽出、分離に広く使用されています。小型の使い捨て実験室用ろ過から生産用ろ過システム、無菌試験、発酵、細胞培養などに至るまで、当社の多くの製品ラインは、試験と生産のニーズを満たします。 Guidling Technology はあなたとの協力を楽しみにしています!