口蹄疫ワクチン製造工程における深部ろ過の適用に関する研究
はじめに - 口蹄疫とは何ですか
14世紀には、ヨーロッパで同様の口蹄疫に関する記録が残っています。口蹄疫は、口蹄疫ウイルスによって引き起こされる急性の発熱性の伝染性の高い病気です。
成体動物の臨床症状には、体温の上昇、口の中の水疱や潰瘍形成、蹄の水疱や潰瘍形成、さらには蹄の脱皮が含まれ、経済動物では摂食や睡眠の困難、体重減少、さらには経済的価値の損失を引き起こします。 ;
若い動物の臨床症状には、体温の上昇、心筋炎、その他の症状が含まれます。一度発症すると、若い動物の死亡率は高くなります。
抽象的な
過去500年にわたり、口蹄疫は世界中で繰り返し発生し、多数の豚、牛、羊などの家畜や野生の偶蹄類の有蹄動物が死亡したり病気になったりして、家畜に深刻な影響を与えています。そして繁殖産業。
口蹄疫ワクチンの製造工程における深層ろ過技術の適用を研究するために、表面ろ過と深層ろ過のろ過性能、および殺菌ろ過の保護効果を試験および比較しました。細胞破片の除去における高電荷ディープフィルトレーションの利点が研究されました。異なる濁度の細胞培養培地に対応する濾過スキームを分析しました。
その結果、深部ろ過負荷は表面ろ過の13.9倍、ろ過液の濁度は表面ろ過の23.5%にすぎず、その後の0.2um除菌負荷は表面ろ過の7.2倍であることがわかりました。表面濾過。特殊な樹脂配位子を使用することにより、フィルター液の濁度が同じ孔径の通常のディープフィルターに比べて38.6%となり、後工程の保護に役立ちます。結果は、深層濾過、特に強力な正電荷の深層濾過が口蹄疫ワクチンの生産に効果的に適用でき、異なる培地に対して適切な濾過プロセスを確立する必要があることを示した。
口蹄疫と深いろ過
口蹄疫 (FMD) は、口蹄疫ウイルス (FMDV) によって引き起こされる、偶蹄類の動物に起こる急性の発熱性伝染病です。この病気に最もかかりやすい動物には、牛、豚、羊が含まれます。口蹄疫はアジア、アフリカ、中東、南米の風土病であり、発生率が非常に高く、急速に伝染します。世界獣保健機関（OIE）は、これを最初のカテゴリーAの人獣共通感染症としてリストしており、加盟国に対し、口蹄疫を届出対象動物疾患のリストに含めることを義務付けている。ワクチン接種は口蹄疫を特異的に予防する効果的な手段です。口蹄疫不活化ワクチンは、完全なウイルスを不活化剤で不活化して作られ、口蹄疫の予防と制御に重要な役割を果たします。
FMDV自体の抗原性は弱く、ウイルスの不活化が抗原に大きな影響を与えます。したがって、現在の口蹄疫ワクチンの生産において、高純度口蹄疫ワクチンは単位用量の抗原含有量と純度を確保することができ、これは特に重要であり、現在のワクチン接種戦略でもある。このため、ウイルスの下流精製には高い要件が求められます。また、2009年以前、中国における口蹄疫の不活化ワクチンの上流では、ボトルを回転させて壁に貼り付ける培養方法が主流でした。ワクチンの需要が高まるにつれ、この培養法の欠点として、多数の回転ボトルが必要であること、効率が低いこと、発現レベルが低いことが徐々に明らかになってきました。
そこで近年、細胞培養技術はそれまでの付着培養から浮遊培養へと徐々に変化し、ウイルス産生能は大幅に向上しました。しかし、ウイルス生産の増加に伴い、培養プロセスによって生成される細胞破片、宿主タンパク質、宿主DNAなどの細胞放出がそれに応じて増加するため、培養モードの変更により下流の精製に対するプレッシャーが増大しています。下流の浄化能力にさらなる要件を課します。
膜濾過技術はワクチンなどの生物由来製品の製造工程で広く使用されており、その中でもDC濾過技術は通常、病気毒の採取工程で細胞破片などの不溶性不純物を分離するために使用されます。初期のFMDV解明では、折り畳み式膜ろ過エレメントに代表される表面ろ過技術が主に採用されていました。培養条件の変化により細胞破片の不純物が増加し、表面濾過では清澄効果が得られにくくなり、また表面濾過負荷が低いためフィルター材料のコストはますます高くなっています。
上記の背景の下、FMDV の細胞液分離のプロセスでは深層ろ過がますます適用されています。ディープフィルター材は通常、天然由来の長くて細い繊維で構成されており、膜形成後のフィルター材によって形成される流路は、迷路開口構造と同様に非常に曲がりくねっていることがよくあります。不純物粒子は多くの場合、表面ではなくフィルターの内部に捕捉されます。また、フィルター流路の壁には、静電気作用や分子間力により極微粒子の不純物の一部が吸着される場合があります。一般に、深層濾過の濾過機構は、機械的保持と吸着によって特徴付けられます。
定電流濾過方式
ディープフィルタープレートを定電流フィルターデバイスに取り付け、フィルタープレートを54 L/m2を超える緩衝液PBSで洗浄します。洗浄が終了したら、ペリスタポンプを起動して液体をゆっくりと送り出し、ポンプ速度を予想流量程度にゆっくりと調整し、液体を濾過します。ろ過プロセス中のろ過量、時間、圧力差、濁度を記録します。抗原検出のために濾液を収集した。
深層濾過のメリット
表面濾過は、フィルター材の表面で粒子を捕捉して濾過を実現する技術です。濾過機構は主に流体ふるい内の粒子のサイズに基づいており、大きな粒子は濾過膜の表面に捕捉されます。深部ろ過では、内部チャネルを利用して深部での粒子の遮断と吸着を行います。両者の比較図を図 1 に示します。
あるメーカーの口蹄疫ワクチンの不活化溶液をそれぞれ0.45umポリプロピレン表面膜と深層フィルタープレートで事前濾過し、次に0.2um殺菌フィルターで濾過しました。ろ過性データを表 1 に示します。
口蹄疫ワクチン不活化液の濁度は77NTUです。細菌を直接濾過すると、大量の細胞断片により必然的に 0.2um フィルター膜がすぐに詰まり、146S vi 粒子の透過に影響を及ぼします。そこで、除菌ろ過の前に前ろ過を設計し、深層ろ過と表面ろ過の2つの前ろ過方法を比較しました。濾過には二重層のディープフィルタープレートが選択され、負荷は641 L / m2で、ディープフィルターは77 NTUの材料を9.65 NTUに削減し、透明で明るいです。 0.45um の表面ろ過負荷はわずか 46 L/m2 であり、ろ過液の濁度は 41 NTU と高く、前ろ過には適していません。その後の0.2um脱菌ろ過負荷の比較によると、深層ろ過後の脱菌ろ過膜負荷は655 L/m2であり、これは対応する表面ろ過のろ過負荷（わずか91 L/m2）の7.2倍です。 。
146S のテスト結果は、深層ろ過システムの収量が表面ろ過システムの収量よりも高いことを示しています。深層濾過負荷は表面濾過の13.9倍、濾液の濁度は表面濾過の23.5%に過ぎず、その後の0.2um細菌除去濾過負荷は表面濾過の7.2倍でした。表面濾過。したがって、コストの観点と収量の観点の両方から見て、深層濾過システムは表面膜濾過システムよりも大幅に優れています。
強正電荷ディープフィルターのメリット
正電荷ディープフィルタープレートと強正電荷ディープフィルタープレートを使用して、異なる供給源からの口蹄疫ワクチンの不活化溶液を比較しました。濾過性の結果を表2に、濾過工程における濾過速度と圧力差の変化をカラーレイアウト2に示します。
使用した 2 つのグループのディープフィルタープレートは同じ開口精度を持ち、負荷と圧力差の変化の観点から性能は非常に一貫しており、図 2 の圧力差の変化曲線は基本的に同一です。
しかし、濾過液の濁度からするとその差は非常に大きい。通常の正に帯電した二重層フィルタープレートのフィルター液は 25 NTU ですが、同じ口径の強プラスに帯電した深層フィルタープレートのフィルター液はわずか 9.65 NTU であり、通常の深層フィルタープレートの 38.6% にすぎません。これは主に、強力な正電荷のディープフィルタープレートフィルター素材に含まれる特殊な樹脂リガンドによるものです。強陽性二層フィルタープレートにより濁度は 10NTU 未満に低減され、細胞断片は完全に吸着またはトラップされるため、その後の限外濾過または殺菌濾過プロセスに役立ちます。不溶性細胞破片に対する吸着効果に加えて、Yigzaw Y らは細胞宿主タンパク質に対する強正電荷ディープフィルタープレートの除去効果を報告し、Dorsey N らは強正電荷ディープフィルタープレートの除去効果を報告しています。 DNAについて。
深層ろ過による口蹄疫ワクチン上清の清澄ろ過プロセスの確立
上記の表面濾過と深層濾過の比較研究、および特別な強力な正電荷の深層フィルタープレートの浄化効果の研究を通じて、異なる濾過スキームを、異なる濾過スキームを異なる条件下で製造された口蹄疫ワクチンの不活化上清に適合させる必要がある。培養条件。 3 つの異なる濁度、低濁度、中濁度、高濁度の遠心上清について、深層濾過スキームと対応する濾過パラメーターを表 3 に示します。
濁度の低い遠心上清の場合、単層ディープフィルタープレートが効果的に清澄化し、少量の細胞破片を除去できます。中程度の濁度の遠心上清の場合、二層ディープフィルタープレートは効果的に清澄でき、特に強い正電荷のディープフィルタープレートは濁度を5NTU未満に下げることができます。遠心上清の濁度が高い場合には、フィルタープレートを組み合わせて効果的に清澄することができます。いずれの工程においても、処理能力は500～800L/m2、ろ過液の濁度は20NTU以下で、目的の抗原は十分に回収されており、大量生産に適しています。
議論
アスベスト材料には発がん性物質が含まれているため、1970年代にはろ材にアスベスト材料を使用しないことが指定されました。ディープフィルター材にはアスベストが含まれておらず、より強いプラス電荷を持っています。濾材は木質繊維マトリックスと濾過助剤から作られています。製造プロセスでは、基本コンポーネントを接続するためにポリマー樹脂が使用され、その中の正電荷官能基がディープフィルター素材の電荷吸着能力を効果的に与えます。微粒子の捕集能力に対する吸着型深層ろ過の優れた性能を図 3 に示します。
この実験では、FMDV培養液の濾過試験を明確にするために、異なる樹脂成分と異なる精密ディープフィルター材料を選択し、表面濾過との比較試験を実施しました。結果は、細胞破片の除去には表面濾過よりも深層濾過の方が適しており、その後の微生物負荷制御濾過ユニット (0.2um) に役立つことがわかりました。さらに、強正帯電ディープフィルタープレートと通常の正帯電ディープフィルタープレートの濾過効果を比較すると、強正帯電フィルタープレートは強力な濁度制御能力を示し、濁度を5NTU未満に低減できます。これは、濾過プロセス全体の堅牢性の向上に非常に役立ちます。
上流の培養プロセスは、有効成分の収穫ステップに大きな影響を与えます。テストを通じて、この実験は最終的に、異なる濁度の細胞培養培地に対する拡張可能な濾過スキームを確立しました。これは、大規模生産にとって一定の指針となる重要性があります。
Guidling Technologyが発売するデプスフィルターは、ディスクタイプのフィルターエレメントで、フィルター素材としてディープフィルターボール紙を使用した一種の効率的なフィルターエレメントであり、バイオ医薬品の規制要件を完全に満たしており、主に細菌の除去のために特別に設計および製造されています。細胞や細胞断片などの大きな固形分を含み、哺乳動物の細胞培養液に適用できます。細菌および酵母細胞の溶解物の清澄化。宿主細胞タンパク質 (HCP) の除去。ウイルスとDNを削除します。エンドトキシンの除去;消泡剤の除去。
この製品は、デッドボリュームが小さく、線形増幅、ディスクカプセル構造、コンパクトな構造設計という利点があり、他の機器と直列で使用でき、設置面積が小さく、流量が安定し、長寿命で低コストです。