モノクローナル抗体下流工程のウイルス捕捉能力に関する研究
細胞株由来のバイオテクノロジー製品にはウイルス汚染のリスクがある可能性があります。その程度は、調製元、使用される原材料、生産システム、精製試薬、賦形剤などの多くの要因によって異なります。製造プロセスにおけるウイルスの除去または不活化の研究は、病原性ウイルスの医原性感染の可能性を減らし、リスクを軽減するための重要なステップであり、製品の安全性にとって不可欠です。生物学的製剤が臨床試験に参加し、販売される前に、その製造プロセスが既知のウイルスと推定されるウイルスを除去する能力があることを実証する必要があります。
01 モノクローナル抗体製品のウイルス安全性評価
ウイルス除去能力の研究は、通常、既知の力価指標ウイルスをさまざまな製造段階の中間製品に添加し、特定のプロセスで処理されたサンプル中の残留ウイルス力価を測定し、最終的に対数減少値（LRV）を評価することによって行われます。ウイルス力価のこと。 LRV のプロセス ステップ 一般に、4log10 以上が効果的なウイルス除去ステップであると考えられます。 LRVのプロセス<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.
模擬生産工程（短縮工程）の手法を利用する場合には、可能な限り実際の生産工程、特に効果的な生産工程ステップに関連した合理的なウイルス除去・不活化研究・試験計画を立てる必要があります。シミュレートされたプロセスは、テストパラメータと制御条件の点で実際のプロセスと厳密に一致している必要があります。
02 一般的にウイルスと検証スキームを示します
一般的な指標ウイルスを表 1 に示します。
新薬治験申請 (IND) 段階では、バイオテクノロジー製品は少なくとも 2 つのモデル ウイルスのウイルス クリアランス研究を必要とし、通常は 1 つのレトロウイルス (X-MuLV) と 1 つのパルボウイルス (MMV) を選択します。生物製剤ライセンス申請 (BLA) 段階では、通常、3-5 個の特異的/非特異的ウイルスを使用してウイルス除去研究が実施され、3-5 個のプロセスステップが評価されて、製品が安全係数から適切であることを実証されます。ウイルスの安全性の観点。国内外のガイドラインが異なるため、申告に使用されるウイルス除去検証手順にはいくつかの違いがあります。 mAb 製造プロセスで一般的に使用されるウイルス除去検証スキームを表 2 に示します。
03 下流工程のウイルス除去能力
3.1 さまざまなウイルスを除去する下流プロセスの機能
2009 年現在、IND および BLA に関して FDA に提出されたモノクローナル抗体製品には、プロテイン A アフィニティークロマトグラフィー、低 pH、陰イオン交換クロマトグラフィー AEX (フロー浸透モード)、陽イオン交換クロマトグラフィー CEX (結合 - 溶出モード)、およびウイルスクリアランス検証は含まれません。ウイルス濾過は最も一般的に使用される指標ウイルスファミリーであり、その除去効果の平均と範囲を図 1 に示します。
レトロウイルスの場合、LRV が約 3log10 である CEX (図 1 の A 棒グラフを参照) を除いて、他のプロセスは堅牢でした (LRV が 4log10 以上)。ヘルペスウイルスとレトロウイルスは同様のクリアランス効果を持ち、LRV > 4log10 です (図 1 の B 棒グラフを参照)。パルボ ウイルスなどのエンベロープのない小さなウイルスは、効果的に除去することがより難しく、化学処理に耐性があり、フィルターに簡単に捕捉されません (図 1 の C 棒グラフを参照)。 AEX および小型ウイルス フィルターのみがパルボウイルス科の除去に効果的でした (平均 LRV > 4log10)。
図 1 に示すプロセスは、ProteinA、AEX (フロー浸透モード)、CEX (併用溶出モード)、低 pH 不活化 (「不完全」対「完全」除去)、および大口径および小口径のデウイルスろ過です。
3.2 ウイルス除去能力に対する下流プロセスの影響要因
各プロセスの LRV 値の分布を図 2 に示します。比較分析のために、0 ～ 21og10 の研究を低 LRV グループとして分類し、6log10 を超える研究を高 LRV グループとして分類しました。
3.2.1 プロテインA アフィニティークロマトグラフィー
プロテイン A プロセスの LRV 値と、バランス/洗浄緩衝液、充填剤、溶離液組成および溶出 pH 値との間に有意な相関関係はありませんでした。低 LRV グループの共通点は、原料が非常に複雑であることです。原料と充填剤の複雑な相互作用がクロマトグラフィー カラムのウイルス除去能力に悪影響を及ぼしている可能性があります。
3.2.2 AEX (フロースルーモード)
シュトラウスら。 AEX サンプルの pH と導電率が LRV に影響を与える可能性があることを示しました。しかし、Miesegaes らの統計結果では、ProteinA と同様に、AEX (流動浸透モード) の LRV は、さまざまな緩衝液、充填剤、pH および導電率と有意な相関関係がないことが示されました。これは、pH と導電率の最適化によるものと考えられます。報告されたケースのプロセス条件。
3.2.3 CEX(結合 - 溶出モード)
CEX プロセスによるウイルス除去は十分強力ではありません。高 LRV グループの LRV と、緩衝液、経験レベル、またはカラムの高さや樹脂の種類などのクロマトグラフィー カラムの特性との間に有意な相関はありませんでした。ただし、高 LRV 研究で使用された平衡/負荷および溶出 pH 値は両方とも低く、5.3±0.2 でした。低LRVグループでは、pHは6.0±0.2でした。もう 1 つの要因は、緩衝液中の塩濃度も LRV 値の違いを引き起こす可能性があることです。低 LRV 研究で使用した緩衝液の塩濃度は高く、ローディング/バランス溶液の平均濃度は 290±120 mM、溶離液の平均濃度は 340±70 mM でしたが、高 LRV 研究の NaCl 濃度は 58 でした。それぞれ±27 mMおよび183±31 mM。
3.2.4 低 pH の不活化
低 pH プロセスでは、pH が重要なプロセスパラメータであり、レトロウイルスをある程度不活化するには pH 3.8 で十分です。低 LRV グループの pH は 3.9 でしたが、高 LRV 研究では pH 3.4 でした。
3.2.5 ウイルスフィルタリングの削除
小口径フィルターと大口径フィルターの両方で、MuLV 除去の LRV 値は 2log10 以上であり、3log10 を下回った研究はわずか 1% でした (図 2 の h 列と i 列に示されています)。大きな開口部のウイルス フィルターによるレトロウイルスの全体的なクリアランスは、小さな開口部のウイルス フィルターによるものよりも低かった (図 1 の C 棒グラフに示すように)。パルボウイルス除去の結果に影響を与える主な理由は、フィルターの種類の違いです。一般に、ウイルス対策フィルタリングはウイルスを確実に除去できます。
プロセスは、プロテインA(a)、AEX浸透モード(b)、CEX結合-溶出モード(c)、AEX結合Ⅰ溶出モード(d)、低pH不活化(「不完全」および「完全」クリアランス)(e ~ g)、大きな孔径 (h) と小さな孔径 (i ~ j) のウイルス除去 (a ~ i: レトロウイルス、j: パルボウイルス)。
04 ウイルスセキュリティ評価における革新と課題
下流のバイオ医薬品プロセスの分野における継続的な開発と革新は、必然的にウイルスクリアランス評価にも革新をもたらすでしょう。連続ストリームバイオプロセスなどの上流および下流プロセスの進歩により、効果的かつ堅牢なウイルス除去プロセスを評価し確立することが必要になりました。連続フロー中も、ウイルスの不活化やウイルスのフィルタリングなどの手順はバッチ モードで実行されることが予想されます。連続フローモードでのクロマトグラフィープロセスのウイルス除去能力はバッチ処理のウイルス除去能力と実質的に異なるべきではありませんが、データによって裏付けられている必要があります。
05 展望
ウイルス学的安全性の観点から見ると、バイオ医薬品業界の優れた安全性は、業界がウイルス安全性に関する 3 つの重要な戦略を厳格に遵守していることに大きく起因しています。それは、材料および細胞バンクソースの適切な調達とテスト、ウイルスクリアランス評価の文書化 (ウイルス検証研究)、およびプロセス中のウイルス検査。新しい細胞基質によって生産される生物学的医薬品の特性は、さまざまなリスクによって変化する可能性があり、生物学的医薬品の安全性を確保するには優れたリスク管理戦略が必要です。 Guidling Technology は経験豊富な専門技術チームを擁し、小規模試作、パイロット試行から大規模生産までの濾過プロセスをカバーしています。当社の膜および膜フィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過濃縮、抽出および分離に広く使用されています。小型の使い捨て実験室用ろ過から生産指向のろ過システム、無菌試験、発酵、細胞培養などに至るまで、当社の多くの製品ラインは生産性の向上を保証します。
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