血液製剤の不活化・ウイルス除去技術
血液製剤とは、健康なヒト血漿または特に免疫ヒト血漿から分離され、精製または精製された、ヒト血液アルブミン、ヒト免疫グロブリン、ヒト凝固因子（天然または組換え）赤血球濃縮物などの血漿タンパク質成分または血球成分です。診断、治療、または受動的免疫予防のために、組換え DNA 技術によって作られています。」血液製剤は、医療上の緊急事態、戦争傷害の救助、およびいくつかの特定の病気の予防と治療において重要な役割を果たしています。
規制の背景
安全性保証の実践では、最終的な医薬品が規制当局にとって、そして最終的には患者や公衆にとって安全であることを保証する必要があります。 1990年代、国際調整会議（ICH 1998）は「Q5A：ヒトまたは動物起源の細胞株のバイオテクノロジー製品のウイルス安全性評価」（Q5A：ウイルス安全性評価）を発行し、ウイルスの安全性に関する世界標準を確立しました。
ICH Q5A では、この目標を達成するための検証をテストおよびクリアするための多層スキームについて説明しています。このテスト プログラムは、細胞バンク、原材料、バイオリアクターの採取に焦点を当てており、製品のリスク分析によって補完されています。 ICH Q5A では、テストに加えて、上流で汚染物質が検出されなかった場合のフェイルセーフ対策として、下流での汚染除去を評価することを要求しています。クリアランス検証により、ウイルスが試験体制を回避した場合でも、最終的に医薬品となる前に除去および/または不活化できることが保証されます。
ウイルス セキュリティ プログラム全体の背景
現代のバイオテクノロジー製造 (またはバイオプロセス) では、通常、ウイルスを除去または不活化できる精製シーケンス全体で 3 つまたは 4 つの単位操作が行われます。これには、特定のクロマトグラフィー手順 (プロテイン A や陰イオン交換など)、低 pH または界面活性剤の培養、およびウイルス保持フィルターが含まれます。これらの手順すべてがすべてのウイルスを効果的に除去または不活化できるわけではありません。
たとえば、低 pH 培養は通常、非エンベロープ ウイルスの不活化には効果がありませんが、エンベロープ ウイルスの不活化には効果があります。特定の操作条件下では、陰イオン交換カラムは中性等電点ウイルスを結合して生成物の流れから除去できない場合がありますが、酸性ウイルスに対しては効果があります。
これは、バイオテクノロジー製品のウイルスの安全性を確保する、3 ～ 4 つの独立した直交する単位操作の組み合わせです。
一般に、堅牢で効率的かつ信頼性の高い処理ステップにより、多数のウイルス (通常は 4 log10 以上と定義され、対数削減値または LRV は合計ウイルスの log10 として計算されます) を除去または不活化できると考えられています。入力内のウイルスの数を出力内のウイルスの総数で割った値)。ただし、LRV をステップの有効性を示す単一の絶対的な尺度として使用することはできません。データは暫定的なものである可能性があります。モデル化が容易で、プロセス条件の変化の影響を比較的受けにくく、さまざまなウイルスに対して効果的です (WHO 2004)。
ウイルス濾過は、このような強力かつ効果的なプロセスステップとして広く認識されており、バイオテクノロジー製品の製造中に外因性および内因性ウイルス粒子のリスクを最小限に抑えるための戦略全体の重要な要素です。
ウイルス フィルターは、多くの場合、サイズに基づいた強力な保持メカニズムを通じて機能します。この強力な作用機序に基づいて、ウイルスフィルターはクロマトグラフィーステップよりも、さまざまなウイルスに対して予測可能なウイルス保持を提供する可能性が高くなります。これは、フィルターがさまざまなウイルスの物理化学的特性の違いや、動作条件によって規定されるウイルスと樹脂の相互作用の影響を受けにくいためです。したがって、ウイルス濾過ステップは、よく設計された組換え治療用タンパク質精製プロセス (EMEA 1996) で一般的に使用されており、血漿処理産業でも堅牢なパフォーマンスを発揮することが示されています。
しかし、血液製剤は両刃の剣のようなもので、何千人もの命を救うだけでなく、病気を蔓延させ、人間の健康を脅かす可能性もあります。統計によると、1977年から1984年にかけて、米国の少なくとも30人の献血者000がエイズウイルスに感染した血液を受け取った。 1985年、フランスでは血友病患者の3人中1,200人が輸血や血液製剤を通じてエイズに感染した。000
世界保健機関によると、世界中のエイズ感染の 5 ～ 10% は、エイズに感染した血液または血液製剤の輸血によって引き起こされています。中国における最初のエイズ患者は、エイズウイルスに感染した輸入血液製剤を使用したことにより感染した。さらに、血液および血液製剤の輸血によるB型肝炎およびC型肝炎の感染も報告されています。
1. 血液製剤により感染する主なウイルスとその特徴
血液や血液製剤を介して感染するウイルスには、表1に示すように多くの種類があります。その中でも、HIV、HBV、HCVは、その感染率の高さと深刻な被害から、国内外の医学界から懸念されてきました。
血液および血液製剤にはウイルスを拡散させる可能性があるため、病気の予防や治療への応用に深刻な影響を与えています。そのため、血液製剤の製造においては、血液製剤の安全性を確保するためにウイルスの不活化・除去工程を追加する必要があります。
2. ウイルスの不活化・除去の主な方法
血液製剤の安全性を確保するためには、献血者の選定、可能な場合には予防接種、採取した血液の厳格な検査等に加え、血液製剤の不活化・除去ウイルス処理が重要な鍵となります。輸血の安全性。ウイルスを不活化および除去するために一般的に使用されるいくつかの効果的な方法を以下に詳しく説明します。
I. ウイルスの不活化方法
1.パスツール法
この方法の理論的根拠は、温度と作用時間の選択により、ウイルス構造の破壊率がタンパク質構造の破壊率よりもはるかに高いということです。 50年近くにわたる臨床使用の結果と最近の動物実験により、60度、10時間の加熱処理、つまりパスツール消毒後の溶液中のアルブミンはHBVを不活化するだけでなく、HCVおよびHIVも不活化できることが確認されており、アルブミンは最も信頼できるものとなっています。血液製剤のウイルスの安全性。
最近、パスツールのプロセスは、IVIG、FVI、FIX、フィブリノーゲンおよびその他の製品の生産に拡張されました。 Bridonnccu et al.このウイルス不活化プロセスを低温エタノール製造IVIGプロセスに加え、安定剤無添加、低塩分、酸性度の条件下でパスツール法を実施し、ウイルス力価が5Log低下した。シモンズら。英国で臨床使用されているFVⅢおよびFIX濃縮製剤の輸血感染ウイルス(TTV)を検査したところ、パスツールウイルス不活化処理をしていない製品のTTV検出率は50%〜75%であり、陽性検出率は5%であることが判明した。パスツール不活化後の製品の割合は0でした。
非不活化凝固因子製品を使用した英国の血友病患者 84 人の TTV 陽性率は 27% でしたが、ウイルス不活化凝固因子製品を使用した患者 19 人中 1 人のみが陽性であり、陽性検出率は 5% でした。したがって、ウイルスの不活化プロセスは血液製剤の安全性を向上させるのに非常に効果的です。
2. 有機溶剤と界面活性剤の併用（S/D法）
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%。 S/D法により不活化された血液製剤の多くは、長期にわたる臨床応用により安全性と信頼性が証明されており、広く使用されています。ただし、この方法にはパルボウイルス B19、HEV、およびその他のリポでコーティングされていないウイルスに対する不活化能力はありません。
3. 乾熱不活化法
乾熱不活化とは、凍結乾燥製剤を加熱処理し、乾熱によりウイルスを死滅させることを意味します。一般的に使用される乾熱法は、60度〜80度、10〜72時間加熱法と80度、72時間処理法です。 1980年代初頭には、FVIII凍結乾燥濃縮製剤とプロトロンビン複合体を60度～80度で10～72時間加熱することが有用でした。しかし、この方法ではHBV、HCV、HIVを完全に不活化することはできないことが判明しています。 80度、72時間の乾熱処理は、HBV、HCV、HIVを不活化するのに効果的であることが証明されています。最近では、100 度で処理された凝固因子の凍結乾燥製剤の報告もあります。 Xu Jinboらは、IgGを100度で30分間処理し、水疱性口内炎ウイルス8.2 Logを不活化した。人によっては、FVIII を乾燥状態で 68 度で 72 時間凍結乾燥し、その後 100 度で 0.5 ～ 1 時間加熱します。この方法は比較的経済的です。
4. 光化学的方法
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 HIV に結合した細胞の対数、および in vitro での 7 日間の機能保存後も血小板は良好な状態を維持しました。これは臨床試験用に FDA によって承認されています。
このうち、パスツール消毒法とS/D法は米国FDAの認可を受け、世界で広く使用されています。乾熱不活化法は主に凍結乾燥製剤のウイルス不活化に適しています。光化学法は脂質被覆ウイルスに対する強い不活化効果があり、欧州では全血漿ウイルス不活化に使用されており、血球成分中のウイルス不活化に幅広い期待が寄せられている。しかし、これらすべての方法にはそれぞれ独自の欠点があります。たとえば、パスツール滅菌は一部の耐熱性ウイルスの不活化には理想的ではありません。 S/D 法では、リポでコーティングされていないウイルスを効果的に不活化することができませんでした。光化学的方法は、一部の血漿タンパク質の活性を著しく損傷した。現在の追跡調査の臨床使用では、血液製剤がウイルス感染のリスクを完全に排除することを保証できるウイルス不活化法は存在しないことが示されています。
I. ウイルス除去プロセス
血液製剤の製造では、1 つの不活化プロセスですべてのウイルスを不活化することはできません。さらに、ウイルス自体は異種タンパク質であるため、製品を入力すると副作用が発生します。一方で、技術レベルの限界により、未だその特徴が解明されていないウイルスも存在しており、既存のウイルス不活化方法では不活化効果を保証することができません。したがって、不活化だけでは製品の安全性を保証できないため、製品から除去する必要があります。そのため、ウイルス除去技術がますます注目を集めています。一般的に使用される 2 つの効果的なウイルス除去プロセスについて、以下に簡単に説明します。
1. クロマトグラフィー技術
クロマトグラフィー技術とは、さまざまな成分の分離を達成するために、さまざまな成分と固定相の親和性または相互作用の違いを使用することを指します。血液製剤製造の先進技術であるクロマトグラフィー、特にアフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーは、それ自体にウイルスを除去する効果があります。イオン交換クロマトグラフィーの場合、ウイルス除去では浸透よりも溶出の方が利点があります。表 2 は、オーストラリアの CSL 社によるアルブミン製造プロセスにおけるクロマトグラフィー技術による HAV 除去率のデータ統計を示しています。表 2 からわかるように、イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過は HAV の除去により効果的であり、総除去率は 10.9 Log です。
FVIII の生産において、Baxter Healtheare は、抗 FVIII 抗体で処理したゲルを使用してイムノアフィニティークロマトグラフィーを実行します。これにより、(4.2±0.1)Log および (5.3±0.9)Log を非物質から除去できます。 -それぞれPPVおよびHAVなどの脂質コーティングされたウイルス。
2. ナノフィルム濾過
HAV やパルボウイルス B19 など、表面直径が小さい一部のウイルスの場合、ナノメンブレン濾過が最も効果的な除去方法です。タンパク質とウイルスの大きさの違いとフィルター膜によるウイルスの吸着を利用してウイルスを分離します。オランダの Sanquin Blood Supply Site では、プロトロンビン複合体の製造プロセスに 1 段階、2 段階の Planova 15N ナノ膜ろ過を追加することによるウイルスの除去に関する実験室研究が実施されました。 HIV、HAV、およびその他のウイルスの除去率は、ナノメンブレンろ過後にさまざまな程度に増加することがわかりました (表 3 を参照)。
しかし、この方法を工業生産に適用すると、次の問題が発生する可能性があります。まず、製品の粘度が高く、直径の大きなタンパク質が存在するため、フィルターで選択される膜の孔径が小さすぎてはなりません。したがって、HCV などの小さな直径のウイルスの除去が制限されます。次に、フィルター製造工程における膜の孔径制御の安定性がウイルスの除去に影響します。第三に、ウイルス粒子の直径よりも小さい膜の開口部が塞がれると、生成物の流量が減少し、収量に影響します。したがって、加工製品のニーズに適した特性と孔径を備えた膜を選択することが、ナノ膜濾過でウイルスを除去できるかどうかの重要な要素となります。
3. ディスカッション
血液源の品質を確保することを前提として、ウイルスの不活化・除去のプロセスは血液製剤の安全性を確保するために重要かつ必要な手段です。不活化ウイルスプロセスを 1 つだけ使用しただけでは、血液製剤の安全性を完全に保証することはできません。ウイルス不活化技術をベースに、クロマトグラフィーやナノフィルム濾過などのウイルス除去技術を追加し、ウイルス除去率を大幅に高め、ウイルス不活化・除去効果を大幅に向上させた。現在、欧州は、血液製剤の安全性を確保するために、血液製剤の製造工程において少なくとも1回のウイルスの不活化と除去を行わなければならないことを明確に提案しています。
中国の血液製剤メーカーの多くは、製造工程においてパスツール消毒法やS/D法などの不活化ウイルス工程のみを使用しており、血液製剤の品質に重大な影響を与えるウイルス除去工程は行っていない。中国の WTO 加盟により、国産血液製剤の生産プロセスと品質基準は世界と一致することになるが、そうでなければ既存の国内市場シェアを保証できないだけでなく、世界各国の同様の製品と競争することもできない。国際市場。
したがって、中国の血液製剤メーカーは、製品の品質と安全性を十分に確保するために、生産プロセスを改善し、ウイルスの不活化と除去を強化する必要がある。したがって、中国の血液製剤メーカーは、血液製剤の安全性を確保するためにクロマトグラフィーを使用して血液製剤を精製し、ウイルスを除去する傾向になるだろう。
ガイドリングについて
Guidling Technology は、バイオ医薬品、細胞培養、生物医学の精製と濃縮、診断および工業用流体に重点を置いている国家ハイテク企業です。当社は、バイオ医薬品、細胞培養などのアプリケーションシナリオを完全に満たす遠心濾過装置、限外濾過および精密濾過カセット、ウイルスフィルター、TFFシステム、デプスフィルター、中空糸などの開発に成功してきました。当社のメンブレンおよびメンブレンフィルターは、前濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過などの濃縮、抽出、分離に広く使用されています。小型の使い捨て実験室用ろ過から生産用ろ過システム、無菌試験、発酵、細胞培養などに至るまで、当社の多くの製品ラインは、試験と生産のニーズを満たします。 Guidling Technology はあなたとの協力を楽しみにしています!